【摘要】：目的:研究滸苔多糖(Enteromorpha’s polysaccharide,EP)對四氯化碳所致肝損傷的保護作用及其可能機制。方法:1、以雄性ICR小鼠為實驗對象,將84只小鼠隨機分為6組:正常組(Normal),模型組(Model),滸苔多糖低劑量組(LCEP)、滸苔多糖中劑量組(MCEP)、滸苔多糖高劑量組(HCEP)及陽性對照組(Silymarin)。Normal組和Model組灌胃(Intragastric administration,ig)生理鹽水;LCEP、MCEP、HCEP組分別ig給予150mg/kg、300 mg/kg、450 mg/kg的滸苔粗多糖的水溶液;Silymarin組給予140mg/kg水飛薊素水分散液,ig劑量均為10 m L/kg體重(body weight,B.W),灌胃時間為28d。6組均采用基礎飼料喂養(yǎng)。末次給藥1 h后腹腔注射(Intraperitoneal injection,ip)0.1%四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)橄欖油溶液,撤飼料,禁食不禁水16 h。眼球取血并計算肝臟系數。2、測定血清中谷丙轉氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate transaminase,AST)、總膽紅素(Total bilirubin,TBIL)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)指標值,蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)觀察肝臟組織結構,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d UTP缺口末端標記測定法(Terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)計數肝組織細胞凋亡率。肝勻漿,并測定其中的谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、過氧化氫酶(Catalase from micrococcus lysodeiktic,CAT)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)等生化指標。3、實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)測定肝組織中Nrf2、NQO-1、CSE、CBS、3-MST、TLR2、TLR4、TLR9、NF-k B p65、IL-1β、TNF-α、TGF-β、Pin1、Fas、Fasl、Bax、Bcl-2基因的表達量。蛋白質印跡法(Western-Blot)測定胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)、胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-synthase,CBS)、單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)、環(huán)氧化酶-2(Cyclooxgenase-2,COX-2)、核因子E2相關因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、p-Nrf2、血紅素氧化酶-1(Heme oxygennase-1,HO-1)、含熱蛋白結構域3受體(Nucleotide-binding oligomerization domain like receptor family,pyrindomain containing 3,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartic acid specific protease-1,Caspase-1)、消化道皮膚素D(Gasdermin D,GSDMD)、Cleaved Gasdermin D蛋白表達水平。結果:1、CEP對CCl4致小鼠急性肝損傷的宏觀水平保護作用采用0.1%CCl4橄欖油溶液一次性腹腔注射后,與Normal組相比,Model組小鼠肝臟系數、血清ALT和AST酶活性、TBIL、H2S含量較高(P0.05);血清BUN含量較低(P0.01);肝組織病理學檢查可見腫脹的肝細胞、消失或者固縮的細胞核、炎癥細胞浸潤,細胞凋亡率較高(P0.01);肝組織GPx、SOD、CAT活性、GSH含量較低(P0.01),LDH活性、MDA含量較高(P0.05)。與Model組相比,LCEP、MCEP、HCEP組及Silymarin組肝臟系數、血清ALT和AST酶活性、TBIL、H2S含量較低(P0.05),肝組織GPx、SOD、CAT活性、GSH含量較高(P0.05),LDH活性、MDA含量較低(P0.05),肝組織病理學檢查可見腫脹的肝細胞、少量炎癥細胞浸潤,細胞凋亡率較低(P0.01)。2、CEP對CCl4致小鼠急性肝損傷的分子水平保護作用與Normal組相比,Model組小鼠HO-1、CSE、CBS、TLR2、LTR4、TLR9、Pin1、NF-k B p65、TNF-α、TGF-β、Fas、Bax、IL-1β基因表達量較高(P0.05);肝組織中CSE、CBS、i NOS、COX-2、IL-6、MCP-1、NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D、Cleaved Gasdermin D蛋白表達量較高(P0.001);p-Nrf2、HO-1蛋白表量及p-Nrf2與Nrf2蛋白表達的比值較低(P0.001);Nrf2、NQO-1、3-MST、Fasl、Bcl-2基因表達量及Nrf2蛋白表達量差異不顯著(P0.05)。與Model組相比,LCEP、MCEP、HCEP組及Silymarin組CSE、CBS、TLR2、LTR4、Pin1、NF-k B p65、TNF-α、TGF-β、Fas、Bax、IL-1β基因表達量較低(P0.05),MCEP、HCEP組NQO-1基因的表達量較高(P0.05),Silymarin組Bax基因低于Model組(P0.05),但仍高于Normal組(P0.05),HCEP組TLR2、TLR4基因的表達量低于Normal組(P0.05);LCEP、MCEP、HCEP組及Silymarin組CSE、CBS、i NOS、COX-2、IL-6、MCP-1、NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D、Cleaved Gasdermin D蛋白表達量較低(P0.05);p-Nrf2、HO-1蛋白表量及p-Nrf2與Nrf2蛋白表達的比值較高(P0.05);Nrf2、3-MST、TLR9、Fasl、Bcl-2基因表達量及Nrf2蛋白表達量差異不顯著(P0.05)。結論:1、本實驗條件下,采用0.1%CCl4橄欖油溶液可以建立小鼠急性肝損傷模型,可以升高小鼠體內轉氨酶的活性以及血清中總膽紅素、減少血尿素氮含量,引起小鼠肝臟系數的增高,出現明顯的肝組織損傷的病理改變。2、滸苔多糖可以明顯減輕CCl4所致的急性肝損傷狀態(tài),可以降低血清中的轉氨酶活性和總膽紅素、增加血尿素氮含量,降低肝臟系數,改善肝組織的病理生理狀態(tài)。3、CCl4致小鼠急性肝損傷可能跟其抑制機體內抗氧化防御系統(tǒng)有關,而滸苔多糖可通過加強機體內抗氧化防御系統(tǒng),改善肝損傷病理生理狀態(tài)。4、滸苔多糖可能通過Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用。5、CCl4通過H2S/CSE、H2S/CBS體系增加血清中H2S含量,滸苔多糖干預可通過該體系減弱該過程。6、CCl4可以通過Pin1/NF-k B通路發(fā)揮致肝損傷作用,滸苔多糖可通過該通路發(fā)揮抗肝損傷作用。7、滸苔多糖可以通過TLRs/NF-k B通路發(fā)揮抗肝損傷作用。8、CCl4可通過Fas/Fasl、Bax/Bcl-2通路,引起小鼠肝組織凋亡,滸苔多糖可以通過這兩條通路發(fā)揮抗凋亡作用。9、CCl4可能通過NLRP3/Caspase-1/Gasdermin D信號通路引起小鼠肝組織細胞焦亡,滸苔多糖可能通過該通路拮抗這種作用。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R151
【圖文】：

圖 1 鼠李糖標準曲線肝損傷小鼠肝臟系數的影響圖 2）顯示，與 Normal 組相比， Model 組小鼠肝臟0.05），顯示 CCl4急性損傷能引起小鼠肝臟腫大，證摸成功。與 Model 組相比，LCEP 組、MCEP 組、HCEP，差異有顯著性（P<0.05），其中 HCEP 組肝臟系數（P<0.001）。R2 = 0.9993012340 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.糖含量（mg

活性及 TBIL 值均顯著低于 Model 組（P<0.001；P<0.001；P<0.05），AST 活性接近 Normal 組水平（P>0.05），TBIL 值和 Normal 組差異不顯著（P>0.05）。對小鼠血清 BUN 含量進行分析，Model 組的血清 BUN 含量與 Normal 組相比，明顯較低（P<0.01）；與 Model 組比，MCEP 組小鼠血清 BUN 含量明顯較高（P<0.05）；與 Normal 組相比，LCEP 組、HCEP 組、Silymarin 組小鼠血清 BUN 含量明顯較低（P<0.05；P<0.01；P<0.05）。A B

22注：A：Normal；B：Model；C：LCEP；D：MCEP；E：HCEP；F：Silymarin圖 4 各組小鼠肝組織病理切片（HE ×40） 討論本次實驗采取以體內實驗的方法向雄性 ICR 小鼠一次性腹腔注射 0.1% CCl4欖油溶液（V/V），建立急性肝損傷模型。通過對血清中 ALT、AST、TBIL 的檢，以及在試驗結束后，采取分別計算各組小鼠肝臟系數以及對各組小鼠進行肝組 HE 染色，對各組小鼠的肝臟的病理生理狀態(tài)進行初步的評估。其中，ALT、AST反映肝臟受損程度最為敏感的指標，ALT 則是反映肝臟受損程度靈敏度最高的個檢測指標[2]。肝臟有很強大的清除總膽紅素的能力，而總膽紅素對機體的神經統(tǒng)具有很強的損害作用。及時而有效地檢測總膽紅素的量，對肝臟疾病的診斷具重大的意義[35]。血尿素氮通常是被用于衡量腎功能狀況的一個標志物[36]。BUN

【參考文獻】

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本文編號：2771033