發(fā)布時間：2020-07-22 06:27

【摘要】：目的噪聲性聽力損失(noise-induced hearing loss,NIHL)是一種多發(fā)的職業(yè)病,氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基(reactive oxygen species,ROS)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不僅是NIHL耳蝸毛細(xì)胞損傷的重要機制,也是多種感音性耳聾的基本病理學(xué)基礎(chǔ)。JAK-STAT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等重要的生物學(xué)過程,本研究通過探索氧化應(yīng)激狀態(tài)下JAK-STAT信號通路中各STATs因子與毛細(xì)胞株HEI-OC1(House Ear Institute-Organ of Corti 1)凋亡的相關(guān)性,探討STATs各因子的生物學(xué)作用,為NIHL的防治提供理論依據(jù)。方法用含四種不同濃度(0μM、20μM、40μM、60μM)叔丁基過氧化氫(t-BHP)的培養(yǎng)基培養(yǎng)HEI-OC1細(xì)胞48 h,構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型;流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率,實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測氧化應(yīng)激狀態(tài)下HEI-OC1細(xì)胞中各STATs mRNA的表達(dá)水平,根據(jù)其在氧化應(yīng)激狀態(tài)下STATs mRNA的表達(dá)水平及對凋亡的影響,選擇特異性表達(dá)的STAT因子,并針對該轉(zhuǎn)錄因子設(shè)計siRNA(small interfering RNA),通過對該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的抑制觀察其對HEI-OC1細(xì)胞凋亡率及Caspase-3的影響。結(jié)果應(yīng)激狀態(tài)下HEI-OC1細(xì)胞凋亡率隨t-BHP染毒濃度的增加而上升,與對照組(凋亡率3.9%)相比,20、40、60μM染毒組的細(xì)胞凋亡率分別為7.4%、32.0%、91.2%。實時熒光定量PCR檢測STATs mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示與對照組相比STAT1 mRNA的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下降(F=5534.302,P0.01),各染毒組間未見顯著性差異(P0.05);與對照組相比STAT2 mRNA的表達(dá)水平均有明顯變化(F=1259.148,P0.01),20μM染毒組STAT2 mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P0.01),但40、60μM濃度組均出現(xiàn)明顯升高(P0.01);與對照組相比STAT3 mRNA的表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著下降(F=146.038,P0.01),但各染毒組間未見顯著差異(P0.05);STAT4在HEI-OC1細(xì)胞株中未有表達(dá);與對照組相比STAT5 mRNA的表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯下降(F=685.929,P0.01),各染毒組間比較無顯著差異(P0.05);與對照組相比STAT6 mRNA的表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯下降(F=516.11,P0.01),各染毒組間未見顯著差異(P0.05)。STAT2 mRNA的表達(dá)水平在高濃度染毒組明顯具有特異性,設(shè)計STAT2的siRNA觀察其與HEI-OC1細(xì)胞凋亡的關(guān)系,與未干擾組細(xì)胞凋亡率(對照組0.3%、低濃度組6.7%、中濃度組8.3%、高濃度組12.3%)相比,對STAT2進(jìn)行siRNA干擾后的HEI-OC1細(xì)胞的凋亡率明顯上升(對照組1.8%、低濃度組7.4%、中濃度組9.4%、高濃度組14.4%)。Western Blot法檢測分析siRNA干擾前后各染毒組STAT2和Caspase-3的表達(dá)水平,0μM濃度染毒條件下,干擾后的STAT2表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降(t=-10.963,P0.05),Caspase-3表達(dá)水平無明顯差異(t=-0.81P0.05);20μM濃度染毒條件下,干擾后STAT2表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降(t=-23.908 P0.05),Caspase-3表達(dá)水平顯著上升(t=9.77 P0.05);40μM濃度染毒條件下,干擾后STAT2表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降(t=-18.657P0.05),Caspase-3表達(dá)水平顯著上升(t=13.619 P0.05);60μM濃度染毒條件下,干擾后STAT2表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降(t=-14.626,P0.05),Caspase-3表達(dá)水平顯著上升(t=17.546 P0.05)。結(jié)論JAK-STAT信號通路在毛細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞凋亡的發(fā)生過程中具有重要作用,JAK-STAT信號通路中各STAT因子在凋亡中發(fā)生的生物學(xué)作用不同,JAK-STAT2通路具有抑制毛細(xì)胞凋亡作用,推測JAK-STAT1/STAT3/STAT5/STAT6信號通路可能具有促進(jìn)凋亡的生物學(xué)作用,研究結(jié)果為NIHL的機制提供了新的觀點,STAT2可能成為保護(hù)NIHL耳蝸毛細(xì)胞的作用靶點。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R135.8
【圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 氧化應(yīng)激狀態(tài)下 HEI-OC1 細(xì)胞的凋亡水平流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn) siRNA 抑制 STAT2 表達(dá)后 HEI-OC1 細(xì)胞凋亡水平升高,未染毒對照組中用 siRNA 對 STAT2 抑制后,細(xì)胞凋亡率從 0.3%上升到1.8%;20μM 濃度組用 siRNA 對 STAT2 抑制后,細(xì)胞凋亡率從 6.7%上升到7.4%;40μM 濃度組用 siRNA 對 STAT2 抑制后,細(xì)胞凋亡率從 8.3%上升到9.4%;60μM濃度組用siRNA對STAT2抑制后,細(xì)胞凋亡率從12.3%上升到14.4%。0μM 20μM 40μM 60μM

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文STAT1 STAT2 STAT3 STAT5 STA樣本數(shù) 2-ΔΔCtt 值 樣本數(shù) 2-ΔΔCt值 樣本數(shù) 2-ΔΔCt值 樣本數(shù) 2-ΔΔCtt 值 樣本數(shù) 6 1.00±0.01 6 1.01±0.03 6 1.03±0.06 6 1.02±0.05 6 16 0.48±0.01 6 0.67±0.03 6 0.61±0.02 6 0.26±0.03 6 06 0.50±0.01 6 1.86±0.06 6 0.83±0.05 6 0.37±0.02 6 06 0.43±0.01 6 1.48±0.02 6 0.58±0.02 6 0.53±0.02 6 05534.302 1259.148 146.038 685.929 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

圖 3.SiRNA 干擾 STAT2 對氧化應(yīng)激 HEI-OC1 細(xì)胞凋亡率的影響3.4Western Blot 法檢測分析 STAT2 和 Caspase-3 的表達(dá)不同濃度染毒條件下，STAT2 和 Caspase- 3 的表達(dá)水平如表 4 和圖 4。0 濃度染毒條件下， STAT2 經(jīng) siRNA 干擾后表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降（t=-10.963，P＜0.05），Caspase-3 表達(dá)水平較干擾組無明顯差異( t=-0.81 P>0.05)。20 濃度染毒條件下， STAT2 經(jīng) siRNA 干擾后表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降（t=-23.908 P＜0.05），Caspase-3 表達(dá)水平較未干擾組顯著上升（t=9.77 P＜0.05）。40 濃度染毒條件下， STAT2 經(jīng) siRNA 干擾后表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降（t=-18.657 P＜0.05），Caspase-3 表達(dá)水平較未干擾組顯著上升（t=13.619 P＜0.05）。60 濃度染毒條件下， STAT2 經(jīng) siRNA 干擾后表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降（t=-14.626，P＜0.05），Caspase-3 表達(dá)水平較未干擾組顯著上升（t=17.546 P＜0.05 ）。表 4.siRNA 干擾下 STAT2 和 Caspase-3 表達(dá)水平比較（x s）

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本文編號：2765448