【摘要】：目的:鄰苯二甲酸酯類(phthalates,PAEs)是一類被廣泛作為增塑劑的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs),其中鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)運用最廣�，F(xiàn)有研究表明DEHP污染日益嚴重,且具有廣泛的雌性生殖毒性。卵巢是雌性生殖功能的核心器官,卵母細胞數(shù)目在出生前即已固定,若青春期前的原始卵泡受損,將直接影響雌性生育能力。課題組前期研究工作揭示,新生鼠DEHP暴露會顯著抑制原始卵泡的形成,但其機制仍需深入探討。自噬參與維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,前期研究發(fā)現(xiàn)DEHP暴露使自噬標志分子p62、ATG5表達顯著增強,但在DEHP引起的卵泡發(fā)育異常過程中,自噬是否也發(fā)揮作用目前尚不清楚,值得關(guān)注。因此,本研究旨在探討以下問題:(1)全面系統(tǒng)地了解DEHP在新生期和胚胎期暴露對卵巢原始卵泡發(fā)育的影響;(2)明確自噬紊亂是否參與了DEHP暴露所導致的原始卵泡發(fā)育異常這一過程;(3)探討DEHP調(diào)控自噬,抑制卵巢發(fā)育的分子機制,為防控增塑劑污染和保障雌性生殖健康提供實驗及科學依據(jù)。方法:1.動物模型建立及標本收集:將BALB/C鼠隨機分為對照組、DEHP組、3-MA組、DEHP與3-MA聯(lián)合暴露組、Compound C組、DEHP與Compound C聯(lián)合暴露組。新生鼠連續(xù)腹腔注射5天,孕16.5天胎鼠卵巢體外培養(yǎng)6天后收集卵巢組織。2.探討DEHP對原始卵泡發(fā)育的影響:HE染色及卵母細胞計數(shù)分析新生期/胚胎期小鼠卵巢各級卵泡發(fā)育情況。3.研究DEHP對自噬的影響:TME檢測DEHP暴露后卵母細胞中自噬小體的存在情況,western-blot、qRT-PCR和免疫熒光檢測自噬形成及降解過程中標志分子LC3、ATG5、Cathepsin B、Cathepsin L及LAMP2表達水平。4.探討自噬在新生期/胚胎期DEHP暴露引起的原始卵泡早期發(fā)育異常中的作用:利用自噬抑制劑3-MA干擾自噬過程,研究在抑制自噬的情況下DEHP對新生期/胚胎期小鼠卵泡發(fā)育的影響,對卵巢各級卵母細胞進行計數(shù),同時分析已被DEHP抑制的原始卵泡發(fā)育能否得到恢復。5.探討DEHP調(diào)控自噬的信號通路:檢測DEHP暴露后AMPK信號通路標志因子的表達水平,利用AMPK抑制劑Compound C阻斷AMPK信號后,研究自噬關(guān)鍵蛋白的表達情況,并進一步分析原始卵泡發(fā)育情況。結(jié)果:1.新生期/胚胎期DEHP暴露抑制原始卵泡發(fā)育:體內(nèi)外實驗均發(fā)現(xiàn),DEHP暴露使原始卵泡比例顯著減少,合胞體比例增多。2.新生期/胚胎期DEHP暴露誘導自噬:TME檢測發(fā)現(xiàn)DEHP暴露后的卵巢組織卵母細胞中存在明顯的自噬小體,qRT-PCR及western-blot檢測結(jié)果顯示,自噬關(guān)鍵基因LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、Beclin1、Cathepsin L、Cathepsin B、LAMP2表達水平升高。LC3及LAMP2免疫熒光共定位結(jié)果顯示,在DEHP組可觀察到明顯的LC3及LAMP2信號。3.DEHP通過誘導自噬,抑制原始卵泡發(fā)育:利用自噬抑制劑3-MA干擾自噬過程,進一步檢測在抑制自噬的條件下DEHP對原始卵泡發(fā)育的影響。HE及統(tǒng)計結(jié)果顯示,DEHP與3-MA聯(lián)合暴露,原始卵泡比例得到一定程度的恢復,抑制自噬可以一定程度上逆轉(zhuǎn)DEHP對原始卵泡的抑制作用。4.DEHP通過激活AMPK-SKP2-CARM1信號通路,從而誘導自噬,最終抑制原始卵泡發(fā)育:DEHP暴露使AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、FOXO3a、p-FOXO3a(S253)、TFEB和CARM1蛋白水平顯著升高,而SKP2蛋白水平顯著下降。這一結(jié)果提示,新生期/胚胎期DEHP暴露激活AMPK-SKP2-CARM1信號通路。利用AMPK抑制劑Compound C阻斷AMPK信號通路后發(fā)現(xiàn),DEHP上調(diào)的自噬關(guān)鍵蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5和Beclin1水平被Compound C的聯(lián)合暴露下調(diào),且原始卵泡比例得到一定程度的恢復。結(jié)論:新生期/胚胎期DEHP暴露可通過激活AMPK-SKP2-CARM1信號誘導小鼠卵巢細胞自噬,從而抑制原始卵泡發(fā)育,損害卵巢功能。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R114

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