【摘要】：背景及目的納米氧化鋅(ZnO-NPs)的廣泛應(yīng)用極大地增加了職業(yè)人群在生產(chǎn)生活中的接觸機(jī)會。ZnO-NPs經(jīng)呼吸道進(jìn)入機(jī)體后可導(dǎo)致肺部細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)。細(xì)胞自噬作為細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的一種方式,其可通過降解胞內(nèi)受損蛋白、影響相關(guān)信號通路等方式改變細(xì)胞狀態(tài),調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)。為探究ZnO-NPs誘發(fā)炎性反應(yīng)過程中是否誘發(fā)細(xì)胞自噬,以及自噬在ZnO-NPs誘發(fā)的炎性反應(yīng)中是否存在調(diào)節(jié)作用,本課題在體外實(shí)驗的水平上探究不同濃度ZnO-NPs對A549細(xì)胞的炎性及自噬水平的影響,并通過調(diào)節(jié)自噬水平觀察炎性反應(yīng)的改變,進(jìn)而更深入的探索自噬在ZnO-NPs誘發(fā)炎性反應(yīng)中的作用,為預(yù)防及治療ZnO-NPs引起的呼吸系統(tǒng)毒性作用提供深入的理論依據(jù)。方法1.使用濃度為0、5、10、20、40 mg/L的ZnO-NPs作用于A549細(xì)胞,采用CCK-8法測定ZnO-NPs對A549細(xì)胞活性的影響,采用乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒檢測細(xì)胞上清中LDH釋放量。使用酶聯(lián)檢測免疫試劑盒(ELISA)檢測細(xì)胞上清中炎性因子IL-6、TNF-α的表達(dá)水平2.使用濃度為不同濃度0、5、10、15、20、25、30 mg/L的ZnO-NPs作用于A549細(xì)胞24 h,使用Western Blot法檢測細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B及P62表達(dá)水平的改變,選擇合適的染毒濃度。使用20 mg/L ZnO-NPs刺激細(xì)胞0、4、8、12、24、48 h后,檢測LC3B及P62表達(dá)水平選擇合適染毒時間。采用20 mg/L ZnO-NPs刺激24 h后透射電鏡對細(xì)胞中自噬小體形態(tài)進(jìn)行觀察。3.使用自噬抑制劑三甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬激活劑雷帕霉素(RAPA)分別預(yù)處理細(xì)胞1 h后,以20 mg/L ZnO-NPs作用于細(xì)胞24 h,檢測自噬相關(guān)蛋白LC3B、P62表達(dá)水平,細(xì)胞活性,LDH釋放量及IL-6、TNF-α表達(dá)水平。結(jié)果1.ZnO-NPs對A549細(xì)胞活性的影響。隨著染毒劑量的升高,細(xì)胞存活率降低。當(dāng)ZnO-NPs濃度達(dá)到20 mg/L時細(xì)胞活性顯著降低,為63.38%。2.ZnO-NPs對A549細(xì)胞炎性水平的影響隨著染毒劑量的升高,細(xì)胞上清中LDH釋放量逐漸升高。當(dāng)ZnO-NPs濃度達(dá)到10 mg/L時LDH釋放量顯著升高(P0.05),細(xì)胞上清中的IL-6水平顯著升高。當(dāng)ZnO-NPs濃度達(dá)到20 mg/L時,細(xì)胞上清中TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。3.ZnO-NPs對A549細(xì)胞自噬水平的影響ZnO-NPs刺激細(xì)胞后,與對照組相比LC3II水平升高,P62蛋白水平升高(P0.05)。透射電鏡觀察到20 mg/L ZnO-NPs刺激細(xì)胞后,細(xì)胞中自噬小體數(shù)量明顯增多。4.改變細(xì)胞自噬水平對細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響將細(xì)胞分為空白對照組、藥物對照組、ZnO-NPs組及ZnO-NPs+藥物組。染毒24h后,檢測相應(yīng)指標(biāo)。4.1抑制自噬對細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響與對照組相比,ZnO-NPs組與3-MA+ZnO-NPs組自噬水平明顯提高,細(xì)胞活性下降,LDH釋放增加,IL-6及TNF-α表達(dá)升高。與ZnO-NPs組相比,3-MA+ZnO-NPs組細(xì)胞活性升高,LDH釋放量減少,IL-6及TNF-α表達(dá)水平降低(P0.05)。4.2激活自噬對細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響與對照組相比ZnO-NPs組與RAPA+ZnO-NPs組細(xì)胞自噬水平明顯升高,細(xì)胞活性降低,LDH釋放量增多,IL-6及TNF-α表達(dá)水平升高。與ZnO-NPs組相比,RAPA+ZnO-NPs組IL-6水平顯著升高,而細(xì)胞活性,LDH釋放量及TNF-α表達(dá)水平無明顯變化。結(jié)論1.ZnO-NPs可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生炎性及自噬反應(yīng)。2.抑制自噬可以降低由ZnO-NPs誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎性反應(yīng),激活自噬對ZnO-NPs誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)無明顯影響。
【圖文】：

3圖 2. 1 技術(shù)路線2.1 實(shí)驗材料2.1.1 受試對象及染毒物實(shí)驗對象：人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞 A549，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。染毒物：納米氧化鋅顆粒(ZnO-NPs)，，購于南京海泰納米材料有限公司。課題組前期對其進(jìn)行了相關(guān)表征分析，納米氧化鋅顆粒呈白色，球狀，純度為98.8%，比表面積 23.6 m2/g，粒徑為（41.7 ± 26.3）nm[8, 28]。2.1.2 實(shí)驗試劑

-NPs 對 A549 細(xì)胞活性的影響質(zhì)量濃度 0、5、10、20、40 mg/L 的 ZnO-NPs 作用于 A549 細(xì)胞-8 法檢測各組細(xì)胞活性，結(jié)果如圖 3.1 所示。隨著染毒劑量的升高降低趨勢。當(dāng) ZnO-NPs 濃度小于 10 mg/L 時，A549 細(xì)胞活性并無nO-NPs濃度達(dá)到20 mg/L時細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞活性僅為63.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R114

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本文編號：2699861