【摘要】：鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(Di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是一種增塑劑,被廣泛添加到聚氯乙烯中以增加其柔韌性,在多種產(chǎn)品中都有DEHP的使用,如醫(yī)藥用塑料軟管、食品包裝袋以及化妝品等。有研究表明,DEHP及其代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)心臟、肝臟、腎臟和生殖系統(tǒng)造成損害。肝纖維化是一種反復(fù)損傷和愈合的慢性肝損傷過程,包括感染性疾病、毒素暴露、代謝紊亂以及自身免疫性疾病等多種因素影響,已經(jīng)成為了世界性的臨床問題。肝纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)過度沉積為主要病理特征。肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs)是產(chǎn)生ECM的重要來(lái)源,HSCs在受到激活后會(huì)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,引起ECM合成和降解的失衡,從而造成ECM過度沉積。肝纖維化如果不加以防治,可進(jìn)一步惡化成肝硬化甚至肝癌。流行病學(xué)研究表明,每日大量攝入鄰苯二甲酸鹽污染的食品可能是導(dǎo)致肝功能不全的危險(xiǎn)因素之一。長(zhǎng)期接觸DEHP會(huì)影響肝臟疾病,并加劇慢性肝損傷的進(jìn)展。然而,DEHP對(duì)肝纖維化的影響尚不清楚。在本研究中,我們探討了DEHP對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化的影響,并進(jìn)一步揭示其分子機(jī)制。研究目的:明確DEHP對(duì)肝纖維化大鼠病理?yè)p傷加重過程的影響,揭示TGF-β/Smad和p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路在肝纖維化過程中的作用。研究方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,利用CCl4皮下注射誘導(dǎo)肝纖維化的模型,造模的同時(shí)給予灌胃DEHP(0.05,5,500 mg/kg),以及單獨(dú)灌胃DEHP 500mg/kg作為對(duì)照;九周后處死大鼠,HE染色和MASSON染色觀察DEHP對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟病理?yè)p傷狀況;試劑盒檢測(cè)血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和肝組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)以及還原性谷胱甘肽(GSH)的含量;ELISA法檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)水平;Western blot法檢測(cè)α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表達(dá)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,設(shè)置五組:正常組,TGF-β1,TGF-β1+DEHP(6.25,25,100μmol/L),體外培養(yǎng)24h后,CCK-8檢測(cè)DEHP對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響,DCFH-DA探針檢測(cè)DEHP對(duì)LX-2細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,Western blot法檢測(cè)α-SMA、COL-Ⅰ、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果:1.DEHP暴露對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的病理?yè)p傷過程的影響HE染色檢查表明,與正常組相比,CCl4組肝臟組織出現(xiàn)大量脂肪空泡、肝細(xì)胞壞死以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DEHP暴露可顯著加重CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟病理的損傷,DEHP(5和500 mg/kg)組肝組織切片可見細(xì)胞壞死,脂肪變性以及炎癥浸潤(rùn)明顯加重;MASSON染色檢查發(fā)現(xiàn),與正常組相比,CCl4組肝臟血管壁周圍存在明顯的膠原沉積,且有少量的纖維間隔出現(xiàn),DEHP暴露可顯著促進(jìn)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟中膠原的沉積,從輕度的纖維化和脂肪變性轉(zhuǎn)變成重度纖維化和大量的膠原纖維間隔,尤其在DEHP 500mg/kg劑量暴露組膠原沉積最為明顯。在檢測(cè)血清中轉(zhuǎn)氨酶水平發(fā)現(xiàn),與正常組相比,CCl4組血清中AST和ALT的水平明顯升高,DEHP 500mg/kg劑量暴露后顯著提高CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中AST和ALT的水平。提示DEHP可顯著加重CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的肝臟病理?yè)p傷。2.DEHP暴露對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)水平的影響與正常組相比,CCl4能顯著大鼠血清中TNF-α和IL-6水平;與CCl4組相比,中高劑量DEHP(5,500 mg/kg)暴露能顯著促進(jìn)大鼠血清中TNF-α水平,而血清中IL-6水平僅在高劑量DEHP 500 mg/kg出現(xiàn)顯著變化。提示DEHP對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的加重作用與炎癥因子有關(guān)。3.DEHP暴露對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟組織中氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡的影響與正常組相比,CCl4組肝勻漿中MDA明顯上升,SOD和GSH明顯下降。與CCl4組相比,DEHP(5和500 mg/kg)能顯著促進(jìn)肝勻漿中MDA含量,DEHP500mg/kg可顯著降低SOD和GSH活性。提示DEHP暴露加重CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟損傷可能是加重氧化應(yīng)激,破壞了氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡。4.DEHP暴露對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟組織中TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表達(dá)和分布的影響激光共聚焦法檢測(cè)肝組織中TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)和分布。與正常組相比,CCl4組肝組織切片中TGF-β1和α-SMA蛋白的表達(dá)明顯增多,與CCl4組相比,DEHP 500mg/kg能顯著促進(jìn)肝臟組織中TGF-β1蛋白的表達(dá),而DEHP(5和500mg/kg)能顯著促進(jìn)肝組織α-SMA蛋白的表達(dá);免疫組化法檢查COL-Ⅰ和COL-Ⅲ蛋白表達(dá)和分布發(fā)現(xiàn),與正常組相比,CCl4組肝組織切片中COL-Ⅰ和COL-Ⅲ表達(dá)明顯增多,與CCl4組相比,DEHP(5和500mg/kg)暴露能顯著促進(jìn)蛋白的表達(dá)。5.肝組織中α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表達(dá)與正常組相比,CCl4組能夠明顯上調(diào)α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表達(dá);與CCl4組相比,DEHP能顯著促進(jìn)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表達(dá),尤其是DEHP 500mg/kg影響最明顯。提示DEHP可以顯著加重肝纖維化的形成,其機(jī)制可能是通過TGF-β1/Smad和P38MAPK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。6.DEHP對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX-2增殖的影響與正常組相比,TGF-β1刺激后顯著促進(jìn)LX-2細(xì)胞增殖,與TGF-β1組相比,低濃度DEHP暴露可以顯著促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖,而高濃度DEHP暴露可以抑制細(xì)胞的增殖。7.DEHP對(duì)TGF-β1刺激的LX-2細(xì)胞中ROS含量的影響與正常組相比,TGF-β1刺激后顯著提高LX-2細(xì)胞中ROS含量,與TGF-β1組相比,DEHP(100μmol/L)能顯著提高LX-2細(xì)胞中ROS的含量。8.DEHP對(duì)TGF-β1刺激的LX-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表達(dá)影響研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的總體趨勢(shì)與體內(nèi)相一致,與正常組相比,TGF-β1刺激后能顯著促進(jìn)α-SMA、COL-Ⅰ、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表達(dá),與TGF-β1組相比,DEHP能顯著促進(jìn)α-SMA、COL-Ⅰ、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表達(dá),尤其在高濃度DEHP 100μmol/L。結(jié)論:1.DEHP暴露能顯著加重CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的病理?yè)p傷。2.DEHP暴露能顯著促進(jìn)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,破壞氧化酶與抗氧化酶的動(dòng)態(tài)平衡。提示DEHP加重肝纖維化可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。3.DEHP暴露加重肝纖維化的機(jī)制可能與TGF-β1/Smad和p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。
【圖文】：

因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用 Graphpad Prism 6 軟件進(jìn)行繪制柱狀圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 P<0.01 或 P<0.05 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。3 結(jié)果3.1 DEHP 暴露對(duì) CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠體重、肝臟指數(shù)的影響如圖 1A 所示，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，CCl4 組從第 30 天起大鼠體重顯著低于正常組，DEHP 暴露后能明顯加重這種趨勢(shì)，DEHP （500mg/kg）高劑量暴露組與 CCl4 組相比在 24 天后大鼠體重顯著降低。然而，DEHP（0.05 和 5 mg/kg）低中劑量暴露組與 CCl4 組相比，體重沒有顯著變化。單獨(dú)暴露 DEHP 組對(duì)大鼠體重也無(wú)明顯影響。肝指數(shù)作為肝毒性的指標(biāo)，我們檢測(cè)了 DEHP 對(duì)肝指數(shù)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低中劑量 DEHP 對(duì)肝指數(shù)影響不明顯，但在 CCl4 + DEHP500mg/kg 組中顯著性增加（圖 1B）。

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文Compared with the normal group, #p<0.05, ##p<0.01; Compared with CCl4 group, *p<0.05,**p<0.01, n=10 in each group.3.2 DEHP 暴露對(duì) CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清中 AST 和 ALT 的影響AST 和 ALT 水平作為肝損傷的生化指標(biāo)。與正常對(duì)照組相比，CCl4 組和單獨(dú)DEHP 暴露組血清中 AST 和 ALT 水平顯著升高。與 CCl4 組相比，DEHP 暴露顯著提高了這些肝酶水平，中高劑量 DEHP（5 和 500 mg/kg）暴露能顯著增加AST 水平，，而 ALT 水平僅在 DEHP（500 mg/kg）高劑量組顯著增加(圖 2A-B)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114;R575.2

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本文編號(hào)：2697737