【摘要】：鄰苯二甲酸酯(phthalate acid ester,PAEs)是一類人造多功能化學(xué)品,用于各種消費(fèi)品和工業(yè)產(chǎn)品。由于PAEs在產(chǎn)品中為非共價(jià)結(jié)合,因此隨著時(shí)間的推移,PAEs可以從產(chǎn)品中浸出、遷移,通過攝入、吸入、皮膚接觸進(jìn)入人體。PAEs對(duì)生物體具有致癌,致畸和致突變作用,對(duì)生殖發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)也有毒性作用。鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是最常用的鄰苯二甲酸酯之一,在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),10~(-7)M MBP暴露可以增加小鼠睪丸間質(zhì)腫瘤細(xì)胞(MLTC-1細(xì)胞)孕酮合成水平。在類固醇生成細(xì)胞中,膽固醇是合成孕酮的前體,來自于以脂滴形式存儲(chǔ)的膽固醇酯的水解。對(duì)于MBP是否可以影響膽固醇酯合成,尚未有研究。在本研究中我們用MLTC-1細(xì)胞研究SREBP2-STARD4途徑是否參與了MBP促進(jìn)膽固醇酯合成的過程。目的:1、探討鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)對(duì)膽固醇酯合成的影響2、探討類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白4(STARD4)在MBP促進(jìn)膽固醇酯合成中的作用方法:1、MBP(10~(-8)-10~(-5)M)處理小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞(MLTC-1),酶標(biāo)法測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量。2、ORO法觀察MLTC-1細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的分布。3、qRT-PCR法測(cè)定STARD4和SREBP2 mRNA表達(dá)。4、Western Blot法測(cè)定STARD4和SREBP2的蛋白表達(dá)。5、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法觀察MLTC-1細(xì)胞內(nèi)STARD4表達(dá)變化。6、應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)STARD4的表達(dá),再用MBP(10~(-7)M)處理MLTC-1細(xì)胞,觀察MLTC-1細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量。7、應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)SREBP2表達(dá),再用MBP(10~(-7)M)處理MLTC-1細(xì)胞,觀察MLTC-1細(xì)胞內(nèi)STARD4蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量。8、雙熒光素酶標(biāo)記法檢測(cè)SREBP2與STARD4啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合活力。結(jié)果:1、MBP促進(jìn)MLTC-1細(xì)胞中膽固醇酯的合成MLTC-1細(xì)胞暴露于10~(-8)-10~(-5)M MBP后,10~(-7)M MBP劑量下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量相比對(duì)照組明顯增加(p0.05),ORO染色發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)染色相比對(duì)照組明顯加深。2、STARD4在MBP促進(jìn)MLTC-1細(xì)胞膽固醇酯合成中的作用qRT-PCR和Western Blot結(jié)果表明,10~(-7)M MBP處理后,MLTC-1細(xì)胞STARD4 mRNA和蛋白水平與對(duì)照組相比均上升(p0.05)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合激光共聚焦法結(jié)果顯示,10~(-7)M MBP處理后,STARD4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上聚集增多。RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),STARD4表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯水平相關(guān),且再用10~(-7)M MBP處理MLTC-1細(xì)胞后,STARD4蛋白表達(dá)上升,細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯合成增加(p0.05)。3、MBP對(duì)SREBP2基因表達(dá)的影響qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),MBP可促進(jìn)SREBP2mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。采用RNAi技術(shù)抑制SREBP2表達(dá)后,MLTC-1細(xì)胞中STARD4蛋白表達(dá)下降,再用MBP(10~(-7)M)處理MLTC-1細(xì)胞,SREBP2蛋白表達(dá)水平回復(fù)(p0.05)。4、MBP通過SREBP2-STARD4促進(jìn)膽固醇酯合成采用RNAi抑制SREBP2表達(dá)后,MLTC-1細(xì)胞中STARD4蛋白表達(dá)下降,細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量增加。再用MBP(10-~7M)處理MLTC-1細(xì)胞,SREBP2和STARD4蛋白表達(dá)水平回復(fù),細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量降低(p0.05)。采用雙熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SREBP2可與STARD4啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,且MBP(10~(-7)M)增加了SREBP2和STARD4啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合活性(p0.05)。結(jié)論:MBP通過SREBP2-STARD4信號(hào)通路促進(jìn)MLTC-1細(xì)胞膽固醇酯合成。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果1 MBP 促進(jìn) MLTC-1 細(xì)胞膽固醇酯合成MLTC-1 細(xì)胞暴露于 10-8至 10-5M MBP 24h 后，膽固醇酯的水平在 10-7M 顯著增加（圖 1A）。 該結(jié)果與我們前期研究一致，即暴露于 10-7M MBP 后細(xì)胞孕酮合成增加。然后選擇 10-7M MBP 的劑量進(jìn)行 ORO 染色。 如圖 1B 所示，與對(duì)照組相比，10-7M MBP 處理 MLTC-1 細(xì)胞后顏色顯著加深。

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文正。得出 MLTC-1 細(xì)胞中膽固醇酯的水平（A）。 與對(duì)照細(xì)胞相比，* p <0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用油紅 O 染色試劑盒染色，經(jīng)顯微鏡拍攝的膽固醇酯的 ORO 染色（B），標(biāo)尺為 100μ m。2 MBP 對(duì) MLTC-1 細(xì)胞 STARD4 表達(dá)的影響STARD4 可以參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，為了研究 MBP 暴露是否影響MLTC-1 細(xì)胞 STARD4 的蛋白表達(dá)，，我們將細(xì)胞暴露于 10-8至10-5M MBP 24h。結(jié)果表明 STARD4 蛋白和 mRNA 表達(dá)水平均在 10-7M 劑量上調(diào)（圖 2A，B和 C）。 因此 MBP 暴露可以促進(jìn) MLTC-1 細(xì)胞 STARD4 的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2697644