【摘要】：鄰苯二甲酸酯(phthalate acid ester,PAEs)是一類人造多功能化學品,用于各種消費品和工業(yè)產(chǎn)品。由于PAEs在產(chǎn)品中為非共價結合,因此隨著時間的推移,PAEs可以從產(chǎn)品中浸出、遷移,通過攝入、吸入、皮膚接觸進入人體。PAEs對生物體具有致癌,致畸和致突變作用,對生殖發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)也有毒性作用。鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是最常用的鄰苯二甲酸酯之一,在體內的代謝產(chǎn)物為鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),10~(-7)M MBP暴露可以增加小鼠睪丸間質腫瘤細胞(MLTC-1細胞)孕酮合成水平。在類固醇生成細胞中,膽固醇是合成孕酮的前體,來自于以脂滴形式存儲的膽固醇酯的水解。對于MBP是否可以影響膽固醇酯合成,尚未有研究。在本研究中我們用MLTC-1細胞研究SREBP2-STARD4途徑是否參與了MBP促進膽固醇酯合成的過程。目的:1、探討鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)對膽固醇酯合成的影響2、探討類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白4(STARD4)在MBP促進膽固醇酯合成中的作用方法:1、MBP(10~(-8)-10~(-5)M)處理小鼠睪丸間質細胞(MLTC-1),酶標法測細胞內膽固醇酯含量。2、ORO法觀察MLTC-1細胞內膽固醇酯的分布。3、qRT-PCR法測定STARD4和SREBP2 mRNA表達。4、Western Blot法測定STARD4和SREBP2的蛋白表達。5、免疫熒光細胞化學法觀察MLTC-1細胞內STARD4表達變化。6、應用RNAi技術下調STARD4的表達,再用MBP(10~(-7)M)處理MLTC-1細胞,觀察MLTC-1細胞內膽固醇酯含量。7、應用RNAi技術下調SREBP2表達,再用MBP(10~(-7)M)處理MLTC-1細胞,觀察MLTC-1細胞內STARD4蛋白表達水平和細胞內游離膽固醇含量。8、雙熒光素酶標記法檢測SREBP2與STARD4啟動子區(qū)域結合活力。結果:1、MBP促進MLTC-1細胞中膽固醇酯的合成MLTC-1細胞暴露于10~(-8)-10~(-5)M MBP后,10~(-7)M MBP劑量下發(fā)現(xiàn)細胞內膽固醇酯含量相比對照組明顯增加(p0.05),ORO染色發(fā)現(xiàn),脂質染色相比對照組明顯加深。2、STARD4在MBP促進MLTC-1細胞膽固醇酯合成中的作用qRT-PCR和Western Blot結果表明,10~(-7)M MBP處理后,MLTC-1細胞STARD4 mRNA和蛋白水平與對照組相比均上升(p0.05)。免疫熒光細胞化學染色聯(lián)合激光共聚焦法結果顯示,10~(-7)M MBP處理后,STARD4在內質網(wǎng)上聚集增多。RNAi實驗結果發(fā)現(xiàn),STARD4表達水平與細胞內膽固醇酯水平相關,且再用10~(-7)M MBP處理MLTC-1細胞后,STARD4蛋白表達上升,細胞內膽固醇酯合成增加(p0.05)。3、MBP對SREBP2基因表達的影響qRT-PCR和Western Blot實驗結果發(fā)現(xiàn),MBP可促進SREBP2mRNA和蛋白表達水平升高。采用RNAi技術抑制SREBP2表達后,MLTC-1細胞中STARD4蛋白表達下降,再用MBP(10~(-7)M)處理MLTC-1細胞,SREBP2蛋白表達水平回復(p0.05)。4、MBP通過SREBP2-STARD4促進膽固醇酯合成采用RNAi抑制SREBP2表達后,MLTC-1細胞中STARD4蛋白表達下降,細胞內游離膽固醇含量增加。再用MBP(10-~7M)處理MLTC-1細胞,SREBP2和STARD4蛋白表達水平回復,細胞內游離膽固醇含量降低(p0.05)。采用雙熒光素酶標記實驗發(fā)現(xiàn),SREBP2可與STARD4啟動子區(qū)域結合,且MBP(10~(-7)M)增加了SREBP2和STARD4啟動子區(qū)域結合活性(p0.05)。結論:MBP通過SREBP2-STARD4信號通路促進MLTC-1細胞膽固醇酯合成。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學碩士學位論文結 果1 MBP 促進 MLTC-1 細胞膽固醇酯合成MLTC-1 細胞暴露于 10-8至 10-5M MBP 24h 后，膽固醇酯的水平在 10-7M 顯著增加（圖 1A）。 該結果與我們前期研究一致，即暴露于 10-7M MBP 后細胞孕酮合成增加。然后選擇 10-7M MBP 的劑量進行 ORO 染色。 如圖 1B 所示，與對照組相比，10-7M MBP 處理 MLTC-1 細胞后顏色顯著加深。

南京醫(yī)科大學碩士學位論文正。得出 MLTC-1 細胞中膽固醇酯的水平（A）。 與對照細胞相比，* p <0.05，差異有統(tǒng)計學意義。用油紅 O 染色試劑盒染色，經(jīng)顯微鏡拍攝的膽固醇酯的 ORO 染色（B），標尺為 100μ m。2 MBP 對 MLTC-1 細胞 STARD4 表達的影響STARD4 可以參與細胞內膽固醇的轉運，為了研究 MBP 暴露是否影響MLTC-1 細胞 STARD4 的蛋白表達，，我們將細胞暴露于 10-8至10-5M MBP 24h。結果表明 STARD4 蛋白和 mRNA 表達水平均在 10-7M 劑量上調（圖 2A，B和 C）。 因此 MBP 暴露可以促進 MLTC-1 細胞 STARD4 的表達。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R114

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本文編號：2697644