【摘要】：目的:丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一種從水合丙烯腈中萃取并規(guī)模使用的乙烯基單體[1]。常溫下通常以固體結(jié)晶的形式存在,顏色呈白色,主要用于生產(chǎn)聚丙烯酰胺,其聚合物(聚丙烯酰胺)常作為絮凝劑用于處理污水和廢水或作為粘合劑用于造紙和紡織工業(yè)[2]。同時,聚丙烯酰胺在化妝品生產(chǎn)、礦石加工、染料、生物實驗(如凝膠色譜和凝膠質(zhì)譜)中也得到廣泛應(yīng)用。近年來在高溫烹炸的食物中也發(fā)現(xiàn)其存在,且產(chǎn)生數(shù)量跟溫度、水分以及烹炸時間均有聯(lián)系。2002年,瑞典國家食品管理局和斯德哥爾摩大學的研究人員發(fā)現(xiàn),丙烯酰胺在油炸和燒烤食品中的含量超過飲用水規(guī)定限值的500倍[1,3-5]。體細胞和生殖細胞實驗結(jié)果提示ACR是一種神經(jīng)毒物、致畸物以及致突變物[6,7]及可能的人類致癌物(IARC,1994)。其中,人類流行病學調(diào)查已明確ACR對人體的神經(jīng)毒性:從事聚丙烯酰胺生產(chǎn)、使用的中毒病例具有明顯的神經(jīng)中毒毒性癥狀和體征,如四肢無力、共濟失調(diào)、肢端痛覺過敏、震動覺和位置覺減退等。突觸素Ⅰ(synapsinⅠ,SynⅠ)是定位于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)末梢突觸前膜上的特異性磷酸蛋白,是神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)上的關(guān)鍵蛋白。SynⅠ也是當前神經(jīng)研究方向的熱點話題,如阿爾茲海默癥、帕金森氏癥以及小腦萎縮癥等神經(jīng)退行性病變所致疾病均涉及到Syn Ⅰ蛋白的參與。前期研究發(fā)現(xiàn),SynⅠ蛋白正是ACR所致神經(jīng)毒作用機制中的關(guān)鍵功能蛋白之一,在ACR所致神經(jīng)損傷中發(fā)揮著重要作用[8-10]。進一步的研究發(fā)現(xiàn),ACR主要通過信號轉(zhuǎn)導通路途徑起作用,其中MAPK、PKA、NF-KB、AP-1和CaMKⅡ則是主要的信號因子,在Ca2+存在的情況下通過間接信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控SynⅠ蛋白磷酸化水平的變化,影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,從而引起后續(xù)神經(jīng)毒效應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[11,12]。ACR是否通過直接結(jié)合Syn Ⅰ蛋白發(fā)揮其神經(jīng)毒效應(yīng)尚無確切的證據(jù)。以上述實驗結(jié)果為理論導向,本研究擬通過理論模擬方法對ACR與SynⅠ結(jié)合的可能性進行定量的計算和分析,為關(guān)鍵功能蛋白SynⅠ毒效機制的深入探討提供依據(jù),揭示初步的蛋白構(gòu)象層面變化的研究數(shù)據(jù)支撐。本研究主要利用Dock半柔性對接和分子動力學模擬等方法構(gòu)建ACR與蛋白質(zhì)的相互作用模式,通過觀察蛋白質(zhì)與ACR作用前后的三維結(jié)構(gòu)變化以及對接位點等構(gòu)象位置信息,探究ACR對關(guān)鍵功能蛋白SynⅠ的可能效應(yīng)機制,也為后續(xù)的損傷逆轉(zhuǎn)和損傷保護等提供理論和技術(shù)的新視角。方法:1.同源建模法:使用Swiss-Model在線服務(wù)器,通過目標序列與模板序列的匹配、比對結(jié)果校正、主鏈生成、環(huán)區(qū)建模、側(cè)鏈的安裝和優(yōu)化以及模型優(yōu)化等幾個過程模建基于大鼠源性的Syn Ⅰ蛋白,用于后續(xù)的理論模擬,為Dock分子對接提供蛋白質(zhì)初始結(jié)構(gòu);2.Dock方法:采用USCF Chimera模塊構(gòu)建小分子ACR的三維結(jié)構(gòu)并進行能量優(yōu)化操作。采用Dock Prep模塊添加氫原子、Syn Ⅰ蛋白的AMBER ff14SB力場及ACR的AM1-BCC的電荷。分子對接過程的半柔性對接操作均在Dock 6.7程序中運行,得到ACR與SynⅠ蛋白對接的Grid打分。Dock分子對接可以獲得Syn Ⅰ和ACR的半柔性對接結(jié)果,同時也為后續(xù)的分子動力學模擬提供初始結(jié)構(gòu);3.分子動力學模擬:分子動力學模擬所需的初始結(jié)構(gòu)由分子對接結(jié)果提供,所有準備和模擬工作均在AmberTools15中完成。體系經(jīng)過分子動力學能量優(yōu)化等常規(guī)步驟達到平衡。分子動力學模擬結(jié)果可獲得SynⅠ和ACR柔性對接結(jié)果,同時提供SynⅠ蛋白結(jié)合前后構(gòu)象比對結(jié)果。結(jié)果:1.Dock分子對接:結(jié)果表明,在三種結(jié)合模式中,ACR均與Ca2+發(fā)生配位結(jié)合。在體系Ⅰ(Pose 1)中,ACR位于口袋下方,與Ca2+形成2.4A的配位鍵,與周圍氨基酸殘基無明顯的相互作用;在體系Ⅱ(Pose 2)和Ⅲ(Pose3)中,ACR位于口袋上方,與Ca2+分別形成2.3A和2.4A的配位鍵,且分別與Glu373形成3.4A的氫鍵作用與Lys225形成3.2A的氫鍵作用;2.分子動力學模擬:采用分子對接方法獲得小分子ACR與SynⅠ蛋白的初始結(jié)合構(gòu)象,經(jīng)過30ns的分子動力學模擬,得到3種不同的結(jié)合模式-體系Ⅰ和體系Ⅱ與體系Ⅲ。從能量上看,小分子結(jié)合在體系Ⅰ的區(qū)域內(nèi)相對牢固、穩(wěn)定,結(jié)合力強,因此,小分子很有可能以這種方式結(jié)合到SynⅠ蛋白中,進一步導致其結(jié)構(gòu)和功能的改變,進而產(chǎn)生后續(xù)的毒效應(yīng)。從結(jié)構(gòu)上看,體系Ⅱ和體系Ⅲ都趨向于同一種結(jié)合模式,說明該類型模式具有一定的優(yōu)勢;3.通過對比ACR分子與SynⅠ結(jié)合前后的構(gòu)象變化發(fā)現(xiàn):1)小分子以模式Ⅰ方式結(jié)合在蛋白質(zhì)口袋時,會引起Ca2+附近的環(huán)區(qū)(loop)和β-折疊((β-sheet)發(fā)生構(gòu)象變化(其中左側(cè)環(huán)區(qū)外翻),并進一步引起更遠的α-螺旋(α-helix)結(jié)構(gòu)發(fā)生位移。在該模式中,ACR雖未結(jié)合在Ca2+口袋,但通過影響口袋附近的區(qū)域結(jié)構(gòu)影響活性口袋的形狀,從而影響Ca2+、ATP的結(jié)合;2)在模式Ⅱ和Ⅲ中,ACR結(jié)合在Ca2+口袋中,僅引起環(huán)區(qū)的構(gòu)象變化,并未改變β-折疊和α-螺旋的構(gòu)象,對蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的影響較小。結(jié)論:1.Dock對接結(jié)果顯示,SynⅠ蛋白與ACR可以通過某些形式直接結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)功能,但是Ca2+在其中發(fā)揮重要作用。模式Ⅱ和Ⅲ均與Ca2+以三元復合物的形式結(jié)合,且相應(yīng)的結(jié)合位點為Glu373和Lys225。結(jié)果表明Syn Ⅰ蛋白與ACR在Ca2+存在的情況下可發(fā)生直接結(jié)合作用;2.分子動力學模擬結(jié)果顯示,從能量上看,小分子結(jié)合在體系Ⅰ的區(qū)域內(nèi)相對牢固、穩(wěn)定,結(jié)合力強,因此,小分子很有可能以這種方式結(jié)合到SynⅠ蛋白中,進一步導致其結(jié)構(gòu)和功能的改變,進而產(chǎn)生后續(xù)相應(yīng)的毒效應(yīng)。從結(jié)構(gòu)上看,體系Ⅱ和體系Ⅲ都趨向于同一種結(jié)合模式,說明該模式有一定優(yōu)勢。根據(jù)分析,小分子以體系Ⅱ和Ⅲ形式結(jié)合到Syn Ⅰ蛋白的可能性較大,即Asp313、Arg315、Arg328和Ile395等氨基酸殘基可能是ACR結(jié)合到Syn Ⅰ蛋白的結(jié)合位點。通過對比ACR分子與Syn Ⅰ蛋白結(jié)合前后的構(gòu)象變化發(fā)現(xiàn)Syn Ⅰ蛋白在與ACR發(fā)生相關(guān)作用后,會導致其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。3.本研究應(yīng)用計算理論模擬方法探索Syn Ⅰ蛋白結(jié)構(gòu)及其與丙烯酰胺的相互作用,在原子水平評估ACR直接結(jié)合SynⅠ蛋白的關(guān)鍵作用位點的損傷機制,從而為后續(xù)Syn Ⅰ蛋白的結(jié)構(gòu)解析實驗提供一定的理論依據(jù),并為ACR直接結(jié)合Syn Ⅰ蛋白發(fā)揮其神經(jīng)毒效應(yīng)的機制研究奠定科學基礎(chǔ)。
【圖文】：

共得到符合納入標準的相關(guān)文獻１５２篇，排除不相關(guān)文獻得到相關(guān)文獻１２８逡逑篇，，其中符合類別（１）的文獻數(shù)為３４篇，類別（２）相關(guān)文獻數(shù)為４３篇，兩者逡逑均訂涉及文獻共汁５１篇。見圖１。逡逑２．２國內(nèi)外相關(guān)研究分布逡逑本次檢索共得到相關(guān)文獻１２８篇，其中國內(nèi)科研學者所著文獻７８篇，Ｗ外逡逑科研學者所著文獻５0篇。但檢索文獻發(fā)現(xiàn)國外科研學者所著文獻更多，Ｈ足未逡逑納入本次實驗。逡逑２．３類別及相關(guān)內(nèi)容逡逑將三種類別文獻的兩類相關(guān)信息數(shù)據(jù)列入表格，詳細信息見表１及表２。逡逑２０逡逑

Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ的ｓｄｆ格式的２Ｄ結(jié)構(gòu)。并利用Ｌｉｇｐｒｅｐ進行準備，在ＯＰＬＳ－２００５逡逑力場卜得到能較低的三維分子構(gòu)象并在ＰＨ邋５－９范鬧內(nèi)確定小分子的質(zhì)子逡逑化狀態(tài)。優(yōu)化完成后，分子構(gòu)象如下（圖２）：逡逑ｈ２ｃｖ＾ＮＨ２逡逑圖２邋丙烯酰胺分子構(gòu)象逡逑１．２．２大分子準備逡逑２８逡逑
【學位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2688086