【摘要】：目的 十溴聯(lián)苯醚(decabromodiphenyl ether,BDE-209)是一種具有持久性和生物累積特性的環(huán)境污染物,近年來(lái)在世界各地的環(huán)境、野生動(dòng)物和人體內(nèi)均檢測(cè)出其存在。BDE-209對(duì)人體健康主要包括神經(jīng)和神經(jīng)發(fā)育、免疫、胚胎、生殖、致畸性和(潛在)致癌性等損害,其中雄性生殖毒性日益受到關(guān)注。BDE-209可以破壞血液-睪丸屏障(blood-testis barrier,BTB)結(jié)構(gòu)影響精子發(fā)生,但機(jī)制尚不清楚。本課題通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),探討雌激素受體α(estrogen receptor alpha,ERα)在BDE-209破壞大鼠BTB結(jié)構(gòu)中的分子機(jī)制。方法 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用60日齡SPF級(jí)SD雄鼠,隨機(jī)分為四組(溶劑對(duì)照組,0.1 mg/kg BW BDE-209組,0.5 mg/kg BW BDE-209組,2.5 mg/kg BW BDE-209組)。大鼠染毒采用睪丸注射法,12.8天后使用頸椎脫臼法處死并取材。體外實(shí)驗(yàn)使用18-20日齡SPF級(jí)SD雄鼠原代睪丸Sertoli細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后進(jìn)行BDE-209劑量和時(shí)間趨勢(shì)染毒,染毒劑量分別為12.5、25、50μM,染毒時(shí)間分別為6 h、12 h、24 h、36 h、48 h,篩選最適宜的染毒劑量和時(shí)間進(jìn)行PPT處理。分別設(shè)五個(gè)處理組:DMSO組、PPT組、BDE-209組、BDE-209+PPT組、MPP組,染毒時(shí)間為24 h。進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):(1)為觀察BDE-209對(duì)SD雄鼠和原代Sertoli細(xì)胞的毒作用,BDE-209染毒后計(jì)算大鼠睪丸臟器系數(shù),HE染色和PAS染色法觀察BDE-209睪丸注射后SD雄鼠睪丸和各期曲細(xì)精管形態(tài)學(xué)損傷,MTT試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度染毒組細(xì)胞活力。(2)為觀察BDE-209染毒對(duì)SD雄鼠和原代Sertoli細(xì)胞中ERα表達(dá)的影響,采用qRT-PCR和WB試驗(yàn)檢測(cè)ERαmRNA和蛋白表達(dá)。(3)為觀察BDE-209染毒致SD雄鼠和原代Sertoli細(xì)胞BTB相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能改變,采用超微電鏡觀察大鼠睪丸BTB結(jié)構(gòu),采用qRT-PCR、WB和免疫熒光染色方法檢測(cè)BTB相關(guān)蛋白的mRNA、蛋白和位置表達(dá)。(4)為闡明ERα在BDE-209破壞原代Sertoli細(xì)胞BTB結(jié)構(gòu)中的作用,采用qRT-PCR、WB和免疫熒光染色方法檢測(cè)ERα特異性激動(dòng)劑PPT與BDE-209共處理后BTB相關(guān)蛋白的mRNA、蛋白和位置表達(dá)。結(jié)果 (1)BDE-209染毒對(duì)SD雄鼠和原代Sertoli細(xì)胞的毒作用。與對(duì)照組相比,各劑量組大鼠睪丸重量均減小(P0.05),0.5、2.5 mg/kg BW劑量組睪丸系數(shù)減小(P0.05)。HE染色觀察各劑量組管腔內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性顆粒和未成熟精細(xì)胞、支持細(xì)胞空泡化、長(zhǎng)型精子嵌入內(nèi)皮、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和各級(jí)精細(xì)胞數(shù)目減少或缺失。PAS染色可見I-XIV期各期曲細(xì)精管內(nèi)均出現(xiàn)上述損傷。隨染毒濃度和時(shí)間增加,Sertoli細(xì)胞活力逐漸下降,與對(duì)照組相比,當(dāng)BDE-209濃度超過50μM時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)BDE-209染毒對(duì)SD雄鼠和原代Sertoli細(xì)胞中ERα表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比,2.5 mg/kg BW劑量組大鼠睪丸組織中ERα的mRNA和蛋白表達(dá)下降(P0.05)。與對(duì)照組相比,原代Sertoli細(xì)胞50μM和24 h、36 h、48 h染毒時(shí)ERα蛋白表達(dá)下降(P0.05)。(3)BDE-209染毒對(duì)SD雄鼠和原代Sertoli細(xì)胞BTB相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能影響。BTB超微電鏡顯示,2.5 mg/kg BW劑量組緊密連接出現(xiàn)明顯斷裂甚至解體,肌動(dòng)蛋白微絲束出現(xiàn)缺失,支持細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴和大量空泡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,ZO1、Occludin、β-catenin和Formin1在各劑量組mRNA表達(dá)均下降(P0.05);N-cadherin、Eps8在2.5 mg/kg BW劑量組mRNA表達(dá)下降(P0.05);與對(duì)照組相比,染毒組ZO1、Occludin、Eps8和Formin1蛋白表達(dá)下降(P0.05)。原代Sertoli細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,Occludin和β-catenin mRNA表達(dá)下降(P0.05);與對(duì)照組相比,染毒組ZO1、Occludin、Eps8和Formin1蛋白表達(dá)下降(P0.05);時(shí)間趨勢(shì)染毒結(jié)果顯示,ZO1、Occludin、Eps8和Formin1在24 h、36 h、48 h染毒后蛋白表達(dá)下降(P0.05)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,隨著染毒時(shí)間增長(zhǎng),12 h以后,F-actin排列稀疏,出現(xiàn)截?cái)嗷蚺帕形蓙y。2.5 mg/kg BW染毒組可見BTB相關(guān)蛋白表達(dá)強(qiáng)度減弱,且緊緊圍繞胞核,不再定位于細(xì)胞表面。(4)PPT緩解BDE-209對(duì)原代Sertoli細(xì)胞ERα表達(dá)和BTB結(jié)構(gòu)的影響。BDE-209處理后,Occludin和β-catenin mRNA表達(dá)下降(P0.05),且與BDE-209組相比,PPT和BDE-209共處理組Occludin和β-catenin mRNA表達(dá)上升(P0.05)。與BDE-209組相比,共處理組ZO1、Occludin、Eps8和Formin1蛋白表達(dá)均上調(diào)(P0.05)。與BDE-209組相比,共處理組BTB相關(guān)蛋白表達(dá)有恢復(fù)趨勢(shì),Formin1可見排列整齊的微絲束。結(jié)論 DE-209染毒會(huì)引起SD雄性大鼠睪丸和原代支持細(xì)胞中ERα表達(dá)下調(diào)和BTB結(jié)構(gòu)破壞,并引起睪丸形態(tài)學(xué)損傷。PPT處理可以恢復(fù)BDE-209染毒后ERα和BTB相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào),提示雌激素受體α介導(dǎo)BDE-209引起的BTB結(jié)構(gòu)損傷。為進(jìn)一步了解BDE-209引起精子發(fā)生障礙、誘導(dǎo)雄性生殖損傷的分子機(jī)制,尋找篩選雄性生殖損傷的敏感效應(yīng)標(biāo)志物,防治BDE-209類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的雄性生殖功能損傷提供科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

圖 1 動(dòng)物處理示意圖Fig 1 The schematic of animals treatment2.2.2 原代 Sertoli 細(xì)胞處理（1）睪丸原代 Sertoli 細(xì)胞提取。18-20 日齡 SPF 級(jí)雄鼠幼崽 10 只，頸椎脫臼法處死后，75%酒精浸泡 5 min，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間操作臺(tái)，使用滅菌剪刀和鑷子摘取雙側(cè)睪丸，置于預(yù)冷滅菌 PBS 中浸泡 10 min，剝離睪丸白膜和血管，使用無(wú)菌剪刀將組織剪成約 1 mm3碎塊，轉(zhuǎn)移至 PBS 中輕輕攪拌以去除血細(xì)胞，靜置 10 min，棄上清，重復(fù)一次洗滌一次后轉(zhuǎn)移到離心管中。按每只睪丸加入 3 ml 0.25%胰蛋白酶（含 0.05 mg/ml DNase），37℃下 100 r/min 振蕩消化 15-20 min 以釋放 Leydig細(xì)胞，待組織塊呈羽毛狀混懸，加入含胎牛血清（FBS）的 F12/DEME 培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min 離心 5 min，棄上清，，無(wú)血清 F12/DEME 重懸，重復(fù)一次。按每只睪丸加入 3 ml 含 0.1%膠原酶、0.1%透明質(zhì)酸酶、0.05 mg/ml DNase 的消化液，

別為 6 h、12 h、24 h、36 h 和 48 h，篩選最適宜的染毒劑量和時(shí)間以便劑處理。分別設(shè)五個(gè)處理組：DMSO 組、PPT 組、BDE-209 組、BDE-209MPP 組，染毒時(shí)間均為 24 h。實(shí)驗(yàn)處理如下圖所示。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2679417