【摘要】：目的雙酚A(Bisphenol A,BPA)作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的一種,主要應(yīng)用于工業(yè)和日用品生產(chǎn)中,可通過(guò)消化道、呼吸道及皮膚等接觸途徑進(jìn)入機(jī)體,并對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生一定的危害作用。由于其具有弱雌激素樣和強(qiáng)抗雄激素樣作用,可對(duì)雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響,但目前其損傷機(jī)制尚不清楚。因此,本研究利用生命早期環(huán)境暴露劑量下BPA的動(dòng)物染毒模型,采用microRNA芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法進(jìn)行差異基因及信號(hào)通路的預(yù)測(cè),并通過(guò)基因表達(dá)水平、蛋白水平檢測(cè)、形態(tài)學(xué)分析等方法分別對(duì)差異表達(dá)的microRNA(miRNA)、性激素水平及超微結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)等方面進(jìn)行分析及驗(yàn)證,以闡明生命早期BPA暴露對(duì)生殖系統(tǒng)損傷的表觀遺傳學(xué)miRNA調(diào)控的機(jī)制,為BPA雄性損傷的早期生物指標(biāo)檢測(cè)及防治提供理論依據(jù)。方法1.SPF級(jí)1 0周齡健康SD大鼠,其中雄性大鼠30只,雌性大鼠60只。按雌雄比為2:1進(jìn)行合籠,于次日晨進(jìn)行陰道涂片法檢測(cè),檢到精子者記為孕0天(GD0),每日記錄雄鼠交配情況,以避免父源性因素導(dǎo)致的個(gè)體差異保證其均衡性。將受孕母鼠隨機(jī)分為五個(gè)劑量組,于GD5進(jìn)行灌胃染毒,染毒劑量分別為0、0.05、0.5、5、50 mg/kg,以5 ml/kg容積灌胃染毒至GD19,1次/天,分別在GD20、出生后(PND)21及PND56三個(gè)階段處理仔鼠。2.觀察孕期暴露BPA對(duì)GD20的胎鼠的一般毒性情況及胎鼠雌雄比例情況的影響。3.將GD20階段的仔鼠睪丸進(jìn)行microRNA芯片分析并對(duì)GD20、PND21、PND56的仔鼠睪丸的miRNA差異表達(dá)情況進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證,通過(guò)GO分析及Pathway分析對(duì)其影響的毒作用信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。4.觀察PND56階段仔鼠的精子總數(shù)、體重及各臟器系數(shù)的影響;通過(guò)HE染色及透射電鏡對(duì)睪丸組織的損傷情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)損傷情況進(jìn)行觀察;通過(guò)ELISA法測(cè)定卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)三種性激素水平的表達(dá)情況。結(jié)果一、孕期BPA暴露對(duì)GD20雄性胎鼠一般毒性情況及miRNA表達(dá)譜的影響1.對(duì)GD20階段的胎鼠一般毒性情況及雌雄比分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,孕期暴露BPA對(duì)胎鼠的含羊水總重產(chǎn)生一定程度的下降趨勢(shì),但僅在劑量為5 mg/kg時(shí)該影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。從結(jié)果上看,孕期暴露BPA并不影響孕鼠胎盤的重量。但能一定程度造成胎鼠的低體重出生情況,在劑量為0.5、5和50 mg/kg時(shí),下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。然而在雌雄比例上并無(wú)明顯差異(P0.05)。2.通過(guò)對(duì)GD20階段的microRNA芯片結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,5mg/kg劑量組出現(xiàn)133個(gè)miRNA上調(diào)及136個(gè)miRNA下調(diào),0.05mg/kg劑量組出現(xiàn)171個(gè)miRNA上調(diào)及1 24個(gè)miRNA下調(diào);通過(guò)表達(dá)量及差異表達(dá)倍數(shù)交聯(lián)篩選出26個(gè)miRNA進(jìn)行Real-time PCR進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-361-5 和miR-19b-2-5p在0.05及5 mg/kg劑量組出現(xiàn)上調(diào)而miR-203a-3p在5mg/kg劑量組出現(xiàn)下調(diào)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并通過(guò)Pathway分析發(fā)現(xiàn)排在前三位的預(yù)測(cè)信號(hào)通路為Choline metabolism in cancer、MicroRNAs in caner及GABA信號(hào)通路。二、孕期BPA暴露的雄性仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中差異表達(dá)miRNA的改變情況1.運(yùn)用Real-time PCR法對(duì)PND21階段的仔鼠睪丸26種miRNA表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證,PND21,miR-409b在0.05 mg/kg及5 mg/kg劑量組表達(dá)發(fā)生上調(diào)而miR-30b-3p在5 mg/kg劑量組表達(dá)發(fā)生上調(diào)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2.運(yùn)用Real-time PCR對(duì)PND56階段的仔鼠睪丸26種miRNA表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證,從結(jié)果上看,5 mg/kg劑量組與對(duì)照組比較,miR-203a-5p、miR-19b-2-5p、miR-671、miR-409b和miR-30b-3p出現(xiàn)相對(duì)表達(dá)量升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而在0.05 mg/kg劑量組與對(duì)照組比較中,除miR-203a-5p、miR-19b-2-5p、miR-671、miR-409b和miR-30b-3p相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)相應(yīng)升高外,miR-41 0-5p及miR-203a-3p也出現(xiàn)了增高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。三、孕期BPA暴露對(duì)子代雄性大鼠生殖損傷情況的影響1.在PND56階段5和50 mg/kg組的子代雄鼠體重顯著高于對(duì)照組(P0.05);睪丸及腎臟的臟器系數(shù)不同劑量組均出現(xiàn)不同程度的下降,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,僅肝臟系數(shù)在0.5、50 mg/kg劑量組顯著高于對(duì)照組(P0.05);與對(duì)照組比較,精子總數(shù)各劑量組均出現(xiàn)不同程度的降低且在0.05、0.5及5 mg/kg劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.對(duì)三種性激素含量水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,FSH、LH、T在各染毒劑量組均出現(xiàn)降低,而LH和T在0.051mg/kg下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而FSH在50 mg/kg下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.HE染色在0.05 mg/kg劑量組可以看到曲細(xì)精管出現(xiàn)輕微萎縮,部分生精細(xì)胞消失。劑量在0.5 mg/kg時(shí)曲細(xì)精管萎縮,生精細(xì)胞層數(shù)變薄,精子生成減少。劑量為5 mg/kg時(shí)生精細(xì)胞排列出現(xiàn)紊亂萎縮,層數(shù)發(fā)生改變,精子生成減少。當(dāng)劑量達(dá)到50 mg/kg時(shí),睪丸鏡下可見(jiàn)大量多核巨細(xì)胞,但并未出現(xiàn)曲細(xì)精管萎縮現(xiàn)象,精子生成有一定程度減少。從睪丸電鏡下的超微結(jié)構(gòu)上看,線粒體在0.05、0.5 mg/kg劑量組未見(jiàn)明顯異常改變;而當(dāng)劑量上升到5 mg/kg時(shí),鏡下可見(jiàn)線粒體出現(xiàn)斷脊、空泡樣改變。將劑量為50 mg/kg時(shí),線粒體變化更為顯著,大部分均出現(xiàn)線粒體腫脹、斷脊、空泡樣改變。結(jié)論1.孕期暴露低劑量BPA能夠?qū)е伦哟凼蟪霈F(xiàn)精子總數(shù)下降、性激素水平異常及睪丸組織損傷;2.孕期暴露低劑量BPA能夠?qū)е伦哟凼蟛G丸的miRNA表達(dá)情況發(fā)生改變,且這種改變隨著生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)不同程度的改變;3.通過(guò)miRNA芯片技術(shù)及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)獲得,孕期暴露低劑量BPA產(chǎn)生生殖毒性的miRNA調(diào)控機(jī)制可能為:Choline metabolism in cancer、MicroRNAs in caner、GABA信號(hào)通路、Phosphatidylinostol信號(hào)通路、Morphine addiction、FoxO信號(hào)通路、Pancreatic secretion、Signaling pathways regulating pluripotency、VEGF信號(hào)通路和Retrograde endocannabinoid信號(hào)通路,但具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。
【圖文】：

們選擇差異倍數(shù)為２倍作為本研宄的篩選指標(biāo)。在５邋ｍｇ／ｋｇ組中，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)逡逑照組相比，１３３個(gè)ｍｉＲＮＡ上調(diào)，１３６個(gè)ｍｉＲＮＡ下調(diào)。隨后我們還發(fā)現(xiàn)，，與對(duì)照逡逑組相比，０．０５ｍｇ／ｋｇ組有１７１個(gè)ｍｉＲＮＡ上調(diào)，１２４個(gè)ｍｉＲＮＡ下調(diào)。詳見(jiàn)圖１和表逡逑４0逡逑２２逡逑

由于芯片篩選的ｍｉＲＮＡ數(shù)目過(guò)多，本研究不可能完成全部驗(yàn)證，因此，本研逡逑究通過(guò)將５ｍｇ／ｋｇ與對(duì)照組比較ｍｉＲＮＡ表達(dá)量（平均值＞５００）和差異表達(dá)倍數(shù)（差逡逑異倍數(shù)＞２）雙重交聯(lián)后篩選出本研宄目的ｍｉＲＮＡ，己開(kāi)展下一步研宄，詳見(jiàn)
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2664917