發(fā)布時(shí)間：2020-04-30 22:55

【摘要】：細(xì)顆粒物(Fine particulate matter,PM2.5)是空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5μm的顆粒物,是大氣污染物的主要成分。PM2.5易吸附空氣中的重金屬、微生物、有機(jī)物等有毒有害物質(zhì),通過呼吸系統(tǒng)進(jìn)入人體,危害機(jī)體健康,但其損害作用及其機(jī)制仍未完全闡明。本研究利用PDMS材料,通過人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)共培養(yǎng),兩種細(xì)胞和聚碳酸酯膜共同模擬肺泡-毛細(xì)血管屏障在體內(nèi)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征和功能,構(gòu)建了肺組織芯片,進(jìn)行PM2.5的肺毒性分析。觀察了PM2.5對(duì)A549細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和肺組織芯片模式下凋亡的影響,并探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化損傷在凋亡發(fā)生發(fā)展中的作用,為揭示PM2.5對(duì)肺組織的損傷作用提供了科學(xué)依據(jù)。目的:1.建立肺組織芯片模型,探討PM2.5的毒性作用。2.探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑在PM2.5導(dǎo)致的A549細(xì)胞凋亡中的作用。方法:1.PM2.5的采集及成分分析采用中流量空氣顆粒物采樣器進(jìn)行采樣,采用稱重法測(cè)定PM2.5質(zhì)量濃度、電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定重金屬、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定多環(huán)芳烴、離子色譜法測(cè)定水溶性離子。2.單獨(dú)培養(yǎng)模式下PM2.5對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(1)建立細(xì)胞模型:設(shè)立對(duì)照組、10、20、50、100μg/mL PM2.5染毒組,染毒24小時(shí)。(2)利用CCK-8(Cell Counting Kit-8)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率。(3)采用流式細(xì)胞儀通過異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)雙染標(biāo)記,檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。(4)利用活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、超氧化物岐化酶(Super Oxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)等生化試劑盒檢測(cè)氧化損傷等指標(biāo)。(5)Western-Blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP、PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Caspase-3表達(dá)情況。3.肺組織芯片模式下PM2.5對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(1)采用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)材料、聚碳酸酯膜制作肺組織芯片。(2)并利用液體交換、細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞凋亡率、ROS、炎癥因子(IL-1α、IL-1β、IL-6和IFN-α)等指標(biāo)對(duì)該模型的功能進(jìn)行驗(yàn)證。(3)利用NAC進(jìn)行干預(yù),分為對(duì)照組、PM組、PM+NAC組,染毒24 h,通過ROS、細(xì)胞凋亡率、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)情況探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PM2.5誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的作用。結(jié)果:1.PM2.5成分分析研究期間PM2.5質(zhì)量濃度范圍264-487μg/m~3,平均質(zhì)量濃度為413.83μg/m~3。12種金屬和類金屬元素中,Al的含量最高,其次是Pb、Mn和Cr;16種多環(huán)芳烴均有檢出,其中茚并[1,2,3-c,d]芘的含量最高,其次是苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽和苊烯;4種無機(jī)水溶性離子中,含量最高的為SO_4~(2-),其次為NO_3~-和NH_4~+,含量最低的為Cl~-。2.單獨(dú)培養(yǎng)模式下PM2.5對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(1)隨染毒濃度的增加,A549細(xì)胞存活率逐漸降低(P0.05),表明PM2.5抑制A549細(xì)胞存活并且存在劑量關(guān)系。(2)隨染毒濃度的增加,A549細(xì)胞的凋亡率逐漸升高(P0.05)。表明PM2.5會(huì)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。(3)隨染毒濃度的增加,ROS水平、MDA含量逐漸升高(P0.05);SOD和GSH-Px活力隨染毒濃度的增加而逐漸降低(P0.05)。表明PM2.5可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞氧化損傷。(4)細(xì)胞內(nèi)BIP、PERK、p-eIF2α、Caspase-3蛋白的表達(dá)量隨著染毒濃度的增加而升高(P0.05),p-eIF2α蛋白與eIF2α蛋白比值逐漸升高(P0.05);PM2.5濃度為100μg/mL時(shí)A549細(xì)胞內(nèi)eIF2α蛋白表達(dá)水平下降(P0.05);PM2.5濃度為20、50、100μg/mL時(shí)A549細(xì)胞內(nèi)CHOP蛋白表達(dá)水平隨染毒劑量的增加而升高(P0.05)。蛋白表達(dá)結(jié)果說明PM2.5導(dǎo)致了A549細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,PERK-eIF2α通路被激活,CHOP、Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)量增加導(dǎo)致了A549細(xì)胞凋亡。3.肺組織芯片模式下PM2.5對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響(1)肺組織芯片模式下PM2.5對(duì)A549細(xì)胞的凋亡率高于單獨(dú)培養(yǎng)模式,表明模型的成功建立且凋亡增高的原因至少部分是由活性氧和細(xì)胞間分泌的IL-1β和IL-6增高所造成的。(2)NAC干預(yù)后,PM組ROS水平顯著高于對(duì)照組(P0.05),NAC組、PM+NAC組ROS水平與對(duì)照組見無明顯差異,PM+NAC組ROS水平顯著低于PM組(P0.05),說明NAC能降低ROS水平。(3)NAC干預(yù)后,PM組細(xì)胞總體凋亡率顯著高于對(duì)照組(P0.05),PM+NAC組細(xì)胞總體凋亡率顯著低于PM組且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明NAC干預(yù)后會(huì)抑制A549細(xì)胞凋亡。(4)NAC干預(yù)后,PM組細(xì)胞BIP、PERK、p-eIF2α、Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P0.05),PM+NAC組細(xì)胞BIP蛋白表達(dá)量顯著低于PM組(P0.05);PM組細(xì)胞eIF2α蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組(P0.05),PM+NAC組細(xì)胞eIF2α蛋白表達(dá)量高于PM組(P0.05);PM組和PM+NAC組細(xì)胞p-eIF2α蛋白與eIF2α蛋白比值高于對(duì)照組(P0.05),PM+NAC組細(xì)胞p-eIF2α蛋白與eIF2α蛋白比值顯著低于PM組(P0.05);PM組和PM+NAC組細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組(P0.05),PM+NAC組細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)量顯著低于PM組(P0.05)。說明氧化應(yīng)激是細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的條件,PM2.5可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路造成細(xì)胞凋亡。結(jié)論:1.成功建立肺組織芯片A549細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)模型。2.PM2.5可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,且在肺組織芯片模式下更加明顯,可能與細(xì)胞間分泌的炎癥因子的互相影響有關(guān)。3.PM2.5可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,且在肺組織芯片模式下更加明顯,可能與氧化損傷導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑有關(guān)。
【圖文】：

質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24]；六價(jià)鉻會(huì)通過上調(diào) BIP-PERK 通路蛋白致 A549 細(xì)胞經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)生凋亡[25]。針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)549 細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究認(rèn)為，A549 細(xì)胞受到刺激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志白 BIP 含量迅速升高，隨后下游 PERK-eIF2α 通路蛋白表達(dá)上調(diào)，當(dāng)有刺激未解除或持續(xù)增強(qiáng)時(shí)，促使細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，CHOP、Caspase-3促細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)量增多[26]。目前，PM2.5 是否會(huì)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激徑造成 A549 細(xì)胞凋亡目前并不清楚。本研究利用 PDMS 材料，通過 A549 細(xì)胞和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC）共培養(yǎng)，兩種細(xì)胞和聚碳酸酯膜共同模擬肺泡-毛細(xì)血管屏障體內(nèi)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征和功能，構(gòu)建了肺組織芯片，進(jìn)行 PM2.5 的肺毒分析。觀察了 PM2.5 對(duì) A549 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和肺組織芯片模式下凋亡的響，并探討了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化損傷在凋亡發(fā)生發(fā)展中的作用，，為揭示M2.5 對(duì)肺組織的損傷作用提供了科學(xué)依據(jù)。

圖 2 掩膜示意圖.2 The sketch map of m先在濃硫酸中浸泡，以好的硅片，用去離子離子水沖洗干凈后用分。在潔凈的硅片上勻覆蓋硅片表面，熱圖 3A 所示，調(diào)節(jié)甩膠rpm 保持 30 s。避光靜片放在熱板上避光烘min，緩慢冷卻至室溫紫外的石英玻璃板中和硅片放置在光刻機(jī)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2646267