發(fā)布時間：2020-04-24 00:52

【摘要】：三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)是一種廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中的有機溶劑,同時也是一種常見的環(huán)境污染物,TCE職業(yè)暴露和環(huán)境暴露引起的健康問題成為了人們普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。TCE中毒常伴隨著不同程度的肝損傷,然而,TCE致肝臟損傷具體的分子機制尚未清楚。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TCE可誘導(dǎo)肝細胞SET表達上調(diào),并證實了 SET是TCE致肝細胞毒性的關(guān)鍵蛋白。大量研究表明,SET與表觀遺傳調(diào)控有著密切的聯(lián)系,但是SET如何在TCE致肝細胞毒性中起作用,特別是涉及TCE與SET之間的表觀遺傳調(diào)控機制仍有待進一步研究。在課題組前期研究中篩選出TCE作用下肝細胞中表達下調(diào)、可能靶向調(diào)控SET的miRNA候選分子miR-21a,miR-199b-5p。此外還發(fā)現(xiàn),TCE處理可誘導(dǎo)L-02肝細胞發(fā)生DNA損傷,DNA損傷修復(fù)蛋白p53表達上調(diào),進一步研究表明,SET蛋白可在一定程度上抑制p53的表達。利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SET可介導(dǎo)組蛋白H3K79二甲基化(H3K79me2)修飾水平降低。在此基礎(chǔ)上,本研究深入探索了 SET上下游的表觀遺傳調(diào)控機制及其在TCE致肝細胞毒性中的作用。本研究主要分成以下兩個方面內(nèi)容:研究內(nèi)容1:miRNA調(diào)控SET在TCE致肝細胞毒性中的作用方法:在前期篩選肝細胞中可能靶向作用于SET的miRNA(miR-21a,miR-199b-5p)的基礎(chǔ)上,雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-21a,miR-199b-5p與SET之間的靶向調(diào)控關(guān)系;進一步利用Western blot檢測miRNA高表達與穩(wěn)定干擾L-02肝細胞中SET的變化。流式細胞術(shù)分析TCE處理后正常L-02肝細胞、miRNA穩(wěn)定高表達及穩(wěn)定干擾的肝細胞凋亡的變化。結(jié)果:雙熒光素酶報告基因和Western blot檢測結(jié)果表明miR-199b-5p可以與SET-3' UTR結(jié)合,從而部分抑制SET表達。細胞流式檢測結(jié)果表明,TCE處理后,與正常L-02肝細胞比較,miR-199b-5p低表達時凋亡率明顯升高,提示miR-199b-5p可以在一定程度上緩解TCE誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。結(jié)論:L-02細胞中miR-199b-5p可以與SET-3' UTR結(jié)合,從而部分抑制SET表達,在一定程度上緩解TCE誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。研究內(nèi)容2:SET通過介導(dǎo)H3K79me2調(diào)控p53在TCE致肝細胞DNA損傷中的作用方法:以L-02細胞與SET缺陷L-02細胞為受試細胞,Ommol/L、8mmol/L TCE處理24h后,通過染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)(CHIP-qPCR)檢測DNA損傷修復(fù)基因p53啟動子區(qū)域H3K79me2修飾水平。通過siRNA靶向抑制肝細胞中H3K79特異性甲基轉(zhuǎn)移酶Dot1L,進一步分析H3K79me2對p53的表觀遺傳調(diào)控作用以及p53在TCE致肝細胞DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。結(jié)果:前期研究顯示,TCE致肝細胞毒性作用中,SET能部分抑制p53表達。本研究發(fā)現(xiàn),TCE作用下,L-02肝細胞與SET缺陷L-02肝細胞中p53啟動子區(qū)域組蛋白H3K79me2修飾水平上調(diào)。通過抑制肝細胞中H3K79甲基化轉(zhuǎn)移酶Dot1L后發(fā)現(xiàn),H3K79me2修飾水平下調(diào)時,p53表達也降低。彗星實驗結(jié)果表明,當(dāng)p53表達被抑制時,TCE誘導(dǎo)的L-02肝細胞DNA損傷加重。結(jié)論:SET通過介導(dǎo)p53啟動子區(qū)域H3K79me2降低,部分抑制DNA損傷修復(fù)蛋白p53的表達,而p53表達下調(diào)在一定程度上會加劇TCE致肝細胞DNA損傷。
【圖文】：

肝臟和腎臟也有部分蓄積。ＴＣＥ在機體內(nèi)的代謝途徑主要分為兩種，分別逡逑是發(fā)生在肝臟、腎臟和肺等器官的細胞色素Ｐ４５０邋（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ邋Ｐ４５０，，邋ＣＹＰ）氧逡逑化途徑和腎臟的谷胱甘肽（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，邋ＧＳＨ）結(jié)合途徑（圖１－１）邋［１１，１２］。ＴＣＥ主逡逑要的代謝途徑是細胞色素Ｐ４５０邋（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ邋Ｐ４５０，邋ＣＹＰ）氧化途徑［１３］。據(jù)文獻逡逑２逡逑

ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ穩(wěn)定高表達、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ穩(wěn)定低表達Ｌ－０２細胞和正常Ｌ－０２細胞，逡逑ＴＣＥ染毒２４ｈ后，收集細胞提取細胞內(nèi)總蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析三種細胞ＳＥＴ逡逑表達的變化。實驗結(jié)果如圖２－３所示，與正常Ｌ－０２細胞相比，ＳＥＴ蛋白在逡逑ｍｉＲ－１９％－５ｐ穩(wěn)定高表達Ｌ－０２細胞中表達下調(diào)，而在ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ穩(wěn)定低表達逡逑Ｌ－０２細胞中表達上調(diào)。提示在Ｌ－０２細胞中，ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ能在一定程度上抑制逡逑ＳＥＴ的表達。逡逑２５逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2638340