【摘要】：三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)是一種廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中的有機(jī)溶劑,同時(shí)也是一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物,TCE職業(yè)暴露和環(huán)境暴露引起的健康問(wèn)題成為了人們普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。TCE中毒常伴隨著不同程度的肝損傷,然而,TCE致肝臟損傷具體的分子機(jī)制尚未清楚。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TCE可誘導(dǎo)肝細(xì)胞SET表達(dá)上調(diào),并證實(shí)了 SET是TCE致肝細(xì)胞毒性的關(guān)鍵蛋白。大量研究表明,SET與表觀遺傳調(diào)控有著密切的聯(lián)系,但是SET如何在TCE致肝細(xì)胞毒性中起作用,特別是涉及TCE與SET之間的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。在課題組前期研究中篩選出TCE作用下肝細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)、可能靶向調(diào)控SET的miRNA候選分子miR-21a,miR-199b-5p。此外還發(fā)現(xiàn),TCE處理可誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞發(fā)生DNA損傷,DNA損傷修復(fù)蛋白p53表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步研究表明,SET蛋白可在一定程度上抑制p53的表達(dá)。利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SET可介導(dǎo)組蛋白H3K79二甲基化(H3K79me2)修飾水平降低。在此基礎(chǔ)上,本研究深入探索了 SET上下游的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制及其在TCE致肝細(xì)胞毒性中的作用。本研究主要分成以下兩個(gè)方面內(nèi)容:研究?jī)?nèi)容1:miRNA調(diào)控SET在TCE致肝細(xì)胞毒性中的作用方法:在前期篩選肝細(xì)胞中可能靶向作用于SET的miRNA(miR-21a,miR-199b-5p)的基礎(chǔ)上,雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-21a,miR-199b-5p與SET之間的靶向調(diào)控關(guān)系;進(jìn)一步利用Western blot檢測(cè)miRNA高表達(dá)與穩(wěn)定干擾L-02肝細(xì)胞中SET的變化。流式細(xì)胞術(shù)分析TCE處理后正常L-02肝細(xì)胞、miRNA穩(wěn)定高表達(dá)及穩(wěn)定干擾的肝細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果:雙熒光素酶報(bào)告基因和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明miR-199b-5p可以與SET-3' UTR結(jié)合,從而部分抑制SET表達(dá)。細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果表明,TCE處理后,與正常L-02肝細(xì)胞比較,miR-199b-5p低表達(dá)時(shí)凋亡率明顯升高,提示miR-199b-5p可以在一定程度上緩解TCE誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。結(jié)論:L-02細(xì)胞中miR-199b-5p可以與SET-3' UTR結(jié)合,從而部分抑制SET表達(dá),在一定程度上緩解TCE誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。研究?jī)?nèi)容2:SET通過(guò)介導(dǎo)H3K79me2調(diào)控p53在TCE致肝細(xì)胞DNA損傷中的作用方法:以L-02細(xì)胞與SET缺陷L-02細(xì)胞為受試細(xì)胞,Ommol/L、8mmol/L TCE處理24h后,通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)(CHIP-qPCR)檢測(cè)DNA損傷修復(fù)基因p53啟動(dòng)子區(qū)域H3K79me2修飾水平。通過(guò)siRNA靶向抑制肝細(xì)胞中H3K79特異性甲基轉(zhuǎn)移酶Dot1L,進(jìn)一步分析H3K79me2對(duì)p53的表觀遺傳調(diào)控作用以及p53在TCE致肝細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。結(jié)果:前期研究顯示,TCE致肝細(xì)胞毒性作用中,SET能部分抑制p53表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),TCE作用下,L-02肝細(xì)胞與SET缺陷L-02肝細(xì)胞中p53啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K79me2修飾水平上調(diào)。通過(guò)抑制肝細(xì)胞中H3K79甲基化轉(zhuǎn)移酶Dot1L后發(fā)現(xiàn),H3K79me2修飾水平下調(diào)時(shí),p53表達(dá)也降低。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)p53表達(dá)被抑制時(shí),TCE誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞DNA損傷加重。結(jié)論:SET通過(guò)介導(dǎo)p53啟動(dòng)子區(qū)域H3K79me2降低,部分抑制DNA損傷修復(fù)蛋白p53的表達(dá),而p53表達(dá)下調(diào)在一定程度上會(huì)加劇TCE致肝細(xì)胞DNA損傷。
【圖文】：

肝臟和腎臟也有部分蓄積。ＴＣＥ在機(jī)體內(nèi)的代謝途徑主要分為兩種，分別逡逑是發(fā)生在肝臟、腎臟和肺等器官的細(xì)胞色素Ｐ４５０邋（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ邋Ｐ４５０，，邋ＣＹＰ）氧逡逑化途徑和腎臟的谷胱甘肽（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，邋ＧＳＨ）結(jié)合途徑（圖１－１）邋［１１，１２］。ＴＣＥ主逡逑要的代謝途徑是細(xì)胞色素Ｐ４５０邋（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ邋Ｐ４５０，邋ＣＹＰ）氧化途徑［１３］。據(jù)文獻(xiàn)逡逑２逡逑

ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ穩(wěn)定高表達(dá)、ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ穩(wěn)定低表達(dá)Ｌ－０２細(xì)胞和正常Ｌ－０２細(xì)胞，逡逑ＴＣＥ染毒２４ｈ后，收集細(xì)胞提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析三種細(xì)胞ＳＥＴ逡逑表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖２－３所示，與正常Ｌ－０２細(xì)胞相比，ＳＥＴ蛋白在逡逑ｍｉＲ－１９％－５ｐ穩(wěn)定高表達(dá)Ｌ－０２細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而在ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ穩(wěn)定低表達(dá)逡逑Ｌ－０２細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。提示在Ｌ－０２細(xì)胞中，ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ能在一定程度上抑制逡逑ＳＥＴ的表達(dá)。逡逑２５逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2638340