【摘要】：目的本研究旨在探究微囊藻毒素-LR(MC-LR)對鐵穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機制,分析肝特異性microRNA-122(miR-122)在肝鐵穩(wěn)態(tài)失衡及肝細胞損傷中的作用,為MC-LR誘導鐵穩(wěn)態(tài)失衡及肝毒性提供新的分子機制和治療靶點。方法分別選取8周齡的C57BL/6小鼠和Hfe-/-小鼠,將C57BL/6小鼠隨機分成6組,雌雄各三組(10 ml/kg BW生理鹽水、12.5μg/kg BW MC-LR和25μg/kg BW MC-LR)。將Hfe-/-小鼠隨機分成四組,雌雄各兩組(10 ml/kg BW生理鹽水和25μg/kg BW MC-LR)。選取8周齡的C57BL/6小鼠,隨機分成五組(10ml/kg BW生理鹽水、12.5μg/kg BW MC-LR、25μg/kg BW MC-LR、agomir陰性對照組和25μg/kg BW MC-LR+miR-122 agomir),每天腹腔注射,注射兩周。Agomir陰性對照組和25μg/kg BW MC-LR+miR-122 agomir組分別在每天注射生理鹽水和25μg/kg BW MC-LR基礎上每隔2天注射一次陰性對照agomir和miR-122 agomir,一共四次。血常規(guī)檢測儀檢測血常規(guī)指標;采用iron/TIBC Reagent Set kit檢測血清中鐵含量及未飽和鐵結(jié)合力;普魯士藍染色檢測小鼠肝組織鐵含量。HE染色觀察小鼠肝組織損傷情況;鈾鉛雙染色觀察細胞器損傷;TUNEL染色法檢測肝細胞凋亡。Real time-PCR檢測小鼠肝組織中鐵穩(wěn)態(tài)相關基因和肝細胞凋亡相關基因的相對表達量;Western blotting檢測小鼠肝組織中鐵穩(wěn)態(tài)相關蛋白、凋亡相關蛋白、小腸中鐵輸出蛋白相對表達水平,免疫組織化學法檢測小鼠肝組織肝細胞質(zhì)中Cyt-c的釋放情況。結(jié)果鐵穩(wěn)態(tài)指標檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,RBC、HGB和HCV在兩種小鼠體內(nèi)均升高,MCV、MCH和MCHC均下降。肝鐵和脾鐵在C57BL/6小鼠中升高,但在Hfe-/-小鼠中卻下降。普魯士藍檢測的兩種小鼠肝鐵含量與用試劑盒檢測的肝鐵含量趨勢一致。然而,腎臟鐵在C57BL/6小鼠中是下降的,但在Hfe-/-小鼠中卻是升高的。轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后小鼠肝鐵蓄積現(xiàn)象得到改善。HE染色結(jié)果顯示,對照組C57BL/6小鼠肝組織沒有明顯的損傷,但隨著染毒劑量的升高,組織損傷情況逐漸加重。對照組Hfe-/-小鼠肝組織有輕微損傷,高劑量MC-LR染毒組損傷情況加劇,比C57BL/6小鼠高劑量染毒組嚴重。組織透射電鏡結(jié)果顯示,對照組Hfe-/-小鼠的心、肝、脾組織中細胞器均有不同程度的損傷,且在高劑量染毒組,心、肝、脾組織中細胞器的損傷程度遠遠高于對照組的損傷程度。與對照組相比,隨著染毒劑量的升高,肝細胞凋亡逐漸增多。轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,肝細胞凋亡與肝組織損傷均沒有得到明顯改善。基因檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,隨著MC-LR染毒劑量的增加,miR-122在C57BL/6小鼠肝組織中呈下降趨勢,轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后miR-122表達顯著升高。hepcidin、Bmp6、Il-6在這兩種小鼠肝臟中均下降。在轉(zhuǎn)染組小鼠中,hepcidin、HJV、Hfe、Bmp6、Il-6在小鼠肝組織中均下降,Tmprss6及Hif-1α均升高。轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,hepcidin、HJV、Hfe、Bmp6、IL-6在小鼠肝組織中的表達均得到改善。同時,Tmprss6和Hif-1α的表達受到抑制。隨著染毒劑量的升高,Bax的表達明顯升高,Bcl-w、Bcl-2、caspase-3、caspase-8和caspase-9表達下降。轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,Bax和Bcl-w的表達進一步下降,Bcl-2的表達升高,其他基因沒有明顯變化。蛋白結(jié)果顯示,與對照組相比,FPN1表達上升,p-Smad1和p-Stat3在C57BL/6小鼠體內(nèi)均下降,在Hfe-/-小鼠體內(nèi)沒有明顯改變。在轉(zhuǎn)染組小鼠中,與對照組相比,隨著染毒劑量的升高,小鼠小腸蛋白FPN1的表達逐漸升高,小鼠肝臟蛋白p-Smad1/5/8、p-Stat3和Trf-1的表達均下降,轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,FPN1、p-Smad1/5/8、p-Stat3和Trf-1的表達均升高。隨著染毒劑量的升高,促凋亡蛋白Bax、caspase-3和caspase-8的表達逐漸增加,Bcl-2、Bcl-w和cleaved caspase-3表達下降,caspase-3和cleaved-caspase-9在低劑量組是下降的,在高劑量組caspase-3的表達升高,cleaved-caspase-9沒有明顯改變。轉(zhuǎn)染miR-122agomir后,Bcl-w、Bcl-2、caspase-3和caspase-8的表達下降,cleaved-caspase-9的表達升高。隨著染毒劑量的升高,Cyt-c在細胞質(zhì)中的含量逐漸升高,轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,Cyt-c的表達進一步升高。結(jié)論1.MC-LR可誘導小鼠肝鐵蓄積,這可能是通過下調(diào)Hepcidin的表達導致的,而肝Hepcidin的下調(diào)與IL-6-STAT3和BMP-SMAD信號通路及肝組織中Tmprss6和Hif-1α的表達增加有關。2.MC-LR可以抑制肝特異miR-122的表達,過表達miR-122可改善MC-LR誘導的肝鐵蓄積,這與IL-6-STAT3和BMP-SMAD信號通路及抑制肝組織中Tmprss6和Hif-1α的表達有關。3.MiR-122對MC-LR誘導的肝細胞凋亡及肝組織損傷沒有挽救作用,這與miR-122對bcl-w的抑制有關。
【圖文】：

18圖 3.2 MC-LR 對肝鐵含量的影響注：紅色箭頭指向的棕色位置代表含鐵組織陽性位置。A、B 分別代表 C57BL/6 小鼠和Hfe-/-小鼠肝的普魯士藍染色。 a、b、c、d、e 分別代表對照、12.5μg/kg MC-LR、25μg/kgMC-LR、對照和 25μg/kg MC-LR 組。（a）、（b）分別代表 female 和 male。*代表與對照組相比， p<0.05，差異有統(tǒng)計學意義3.2 MC-LR 對小鼠體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)相關基因和蛋白的影響結(jié)果如圖 3 A 所示，與對照組相比，隨著染毒劑量的升高，在 C57BL/6 小鼠和 Hfe-/-小鼠肝組織中，Hepcidin1、Il-6 和 Bmp6 的表達均是下降的（p<0.05）。結(jié)果如圖 3B 所示，隨著染毒劑量的升高，F(xiàn)PN1 在 C57BL/6 小鼠和 Hfe-/-小鼠小腸組織中均是升高的趨勢（p<0.05）。在調(diào)控 Hepcidin 的經(jīng)典調(diào)控通路中，p-Smad1/5/8 和 p-Stat3 在 C57BL/6 小鼠肝組織中是下降的趨勢（p<0.05），與hepcidin 的變化趨勢一致，但在 Hfe-/-小鼠肝組織中的變化卻不明顯。p-Erk 在

圖 3.3 MC-LR 對鐵穩(wěn)態(tài)相關基因和蛋白的影響注：橫坐標代表檢測的相關指標，縱坐標代表相對于對照組的相比比值。A、B、C、D分別代表 qPCR、蛋白定量、C57BL/6 小鼠和 Hfe-/-小鼠的蛋白條帶結(jié)果。a、b、c、d 在 A、B 中分別代表雌性、雄性 C57BL/6 小鼠和雌雄、雄性 Hfe-/-小鼠。a、b 在 C、D 中分別代表小腸和肝臟的蛋白結(jié)果。*代表與對照組相比， p<0.05，差異有統(tǒng)計學意義3.3 MC-LR 對肝組織損傷及對心、肝、脾等組織細胞器超微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果如圖 4A 所示，在 C57BL/6 小鼠對照組的肝組織中，只觀察到少量的肝細胞質(zhì)疏松（黑色箭頭），未觀察到其他異常的改變，，但隨著染毒劑量的升高，C57BL/6 小鼠肝組織的損傷情況是逐漸加重的，在 12.5 μg/kg MC-LR 組出現(xiàn)肝細胞壞死和核破裂（紅色箭頭），在 25 μg/kg MC-LR 組出現(xiàn)明顯的病理改變，以膠原蛋白增生和肝細胞凋亡為特征。但在 Hfe-/-小鼠對照組中出現(xiàn)肝細胞輕微水腫、肝細胞腫脹、胞漿松染（黑色箭頭），在 25 μg/kg MC-LR 組中，肝細胞水腫、肝細胞腫脹和胞漿松染更加顯著（黑色箭頭），并且在血管周圍出現(xiàn)肝細
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R114

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本文編號：2637541