【摘要】：目的本研究旨在探究微囊藻毒素-LR(MC-LR)對鐵穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機(jī)制,分析肝特異性microRNA-122(miR-122)在肝鐵穩(wěn)態(tài)失衡及肝細(xì)胞損傷中的作用,為MC-LR誘導(dǎo)鐵穩(wěn)態(tài)失衡及肝毒性提供新的分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)。方法分別選取8周齡的C57BL/6小鼠和Hfe-/-小鼠,將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成6組,雌雄各三組(10 ml/kg BW生理鹽水、12.5μg/kg BW MC-LR和25μg/kg BW MC-LR)。將Hfe-/-小鼠隨機(jī)分成四組,雌雄各兩組(10 ml/kg BW生理鹽水和25μg/kg BW MC-LR)。選取8周齡的C57BL/6小鼠,隨機(jī)分成五組(10ml/kg BW生理鹽水、12.5μg/kg BW MC-LR、25μg/kg BW MC-LR、agomir陰性對照組和25μg/kg BW MC-LR+miR-122 agomir),每天腹腔注射,注射兩周。Agomir陰性對照組和25μg/kg BW MC-LR+miR-122 agomir組分別在每天注射生理鹽水和25μg/kg BW MC-LR基礎(chǔ)上每隔2天注射一次陰性對照agomir和miR-122 agomir,一共四次。血常規(guī)檢測儀檢測血常規(guī)指標(biāo);采用iron/TIBC Reagent Set kit檢測血清中鐵含量及未飽和鐵結(jié)合力;普魯士藍(lán)染色檢測小鼠肝組織鐵含量。HE染色觀察小鼠肝組織損傷情況;鈾鉛雙染色觀察細(xì)胞器損傷;TUNEL染色法檢測肝細(xì)胞凋亡。Real time-PCR檢測小鼠肝組織中鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因和肝細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的相對表達(dá)量;Western blotting檢測小鼠肝組織中鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、小腸中鐵輸出蛋白相對表達(dá)水平,免疫組織化學(xué)法檢測小鼠肝組織肝細(xì)胞質(zhì)中Cyt-c的釋放情況。結(jié)果鐵穩(wěn)態(tài)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,RBC、HGB和HCV在兩種小鼠體內(nèi)均升高,MCV、MCH和MCHC均下降。肝鐵和脾鐵在C57BL/6小鼠中升高,但在Hfe-/-小鼠中卻下降。普魯士藍(lán)檢測的兩種小鼠肝鐵含量與用試劑盒檢測的肝鐵含量趨勢一致。然而,腎臟鐵在C57BL/6小鼠中是下降的,但在Hfe-/-小鼠中卻是升高的。轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后小鼠肝鐵蓄積現(xiàn)象得到改善。HE染色結(jié)果顯示,對照組C57BL/6小鼠肝組織沒有明顯的損傷,但隨著染毒劑量的升高,組織損傷情況逐漸加重。對照組Hfe-/-小鼠肝組織有輕微損傷,高劑量MC-LR染毒組損傷情況加劇,比C57BL/6小鼠高劑量染毒組嚴(yán)重。組織透射電鏡結(jié)果顯示,對照組Hfe-/-小鼠的心、肝、脾組織中細(xì)胞器均有不同程度的損傷,且在高劑量染毒組,心、肝、脾組織中細(xì)胞器的損傷程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組的損傷程度。與對照組相比,隨著染毒劑量的升高,肝細(xì)胞凋亡逐漸增多。轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,肝細(xì)胞凋亡與肝組織損傷均沒有得到明顯改善�；驒z測結(jié)果顯示,與對照組相比,隨著MC-LR染毒劑量的增加,miR-122在C57BL/6小鼠肝組織中呈下降趨勢,轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后miR-122表達(dá)顯著升高。hepcidin、Bmp6、Il-6在這兩種小鼠肝臟中均下降。在轉(zhuǎn)染組小鼠中,hepcidin、HJV、Hfe、Bmp6、Il-6在小鼠肝組織中均下降,Tmprss6及Hif-1α均升高。轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,hepcidin、HJV、Hfe、Bmp6、IL-6在小鼠肝組織中的表達(dá)均得到改善。同時(shí),Tmprss6和Hif-1α的表達(dá)受到抑制。隨著染毒劑量的升高,Bax的表達(dá)明顯升高,Bcl-w、Bcl-2、caspase-3、caspase-8和caspase-9表達(dá)下降。轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,Bax和Bcl-w的表達(dá)進(jìn)一步下降,Bcl-2的表達(dá)升高,其他基因沒有明顯變化。蛋白結(jié)果顯示,與對照組相比,FPN1表達(dá)上升,p-Smad1和p-Stat3在C57BL/6小鼠體內(nèi)均下降,在Hfe-/-小鼠體內(nèi)沒有明顯改變。在轉(zhuǎn)染組小鼠中,與對照組相比,隨著染毒劑量的升高,小鼠小腸蛋白FPN1的表達(dá)逐漸升高,小鼠肝臟蛋白p-Smad1/5/8、p-Stat3和Trf-1的表達(dá)均下降,轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,FPN1、p-Smad1/5/8、p-Stat3和Trf-1的表達(dá)均升高。隨著染毒劑量的升高,促凋亡蛋白Bax、caspase-3和caspase-8的表達(dá)逐漸增加,Bcl-2、Bcl-w和cleaved caspase-3表達(dá)下降,caspase-3和cleaved-caspase-9在低劑量組是下降的,在高劑量組caspase-3的表達(dá)升高,cleaved-caspase-9沒有明顯改變。轉(zhuǎn)染miR-122agomir后,Bcl-w、Bcl-2、caspase-3和caspase-8的表達(dá)下降,cleaved-caspase-9的表達(dá)升高。隨著染毒劑量的升高,Cyt-c在細(xì)胞質(zhì)中的含量逐漸升高,轉(zhuǎn)染miR-122 agomir后,Cyt-c的表達(dá)進(jìn)一步升高。結(jié)論1.MC-LR可誘導(dǎo)小鼠肝鐵蓄積,這可能是通過下調(diào)Hepcidin的表達(dá)導(dǎo)致的,而肝Hepcidin的下調(diào)與IL-6-STAT3和BMP-SMAD信號通路及肝組織中Tmprss6和Hif-1α的表達(dá)增加有關(guān)。2.MC-LR可以抑制肝特異miR-122的表達(dá),過表達(dá)miR-122可改善MC-LR誘導(dǎo)的肝鐵蓄積,這與IL-6-STAT3和BMP-SMAD信號通路及抑制肝組織中Tmprss6和Hif-1α的表達(dá)有關(guān)。3.MiR-122對MC-LR誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡及肝組織損傷沒有挽救作用,這與miR-122對bcl-w的抑制有關(guān)。
【圖文】：

18圖 3.2 MC-LR 對肝鐵含量的影響注：紅色箭頭指向的棕色位置代表含鐵組織陽性位置。A、B 分別代表 C57BL/6 小鼠和Hfe-/-小鼠肝的普魯士藍(lán)染色。 a、b、c、d、e 分別代表對照、12.5μg/kg MC-LR、25μg/kgMC-LR、對照和 25μg/kg MC-LR 組。（a）、（b）分別代表 female 和 male。*代表與對照組相比， p<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義3.2 MC-LR 對小鼠體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因和蛋白的影響結(jié)果如圖 3 A 所示，與對照組相比，隨著染毒劑量的升高，在 C57BL/6 小鼠和 Hfe-/-小鼠肝組織中，Hepcidin1、Il-6 和 Bmp6 的表達(dá)均是下降的（p<0.05）。結(jié)果如圖 3B 所示，隨著染毒劑量的升高，F(xiàn)PN1 在 C57BL/6 小鼠和 Hfe-/-小鼠小腸組織中均是升高的趨勢（p<0.05）。在調(diào)控 Hepcidin 的經(jīng)典調(diào)控通路中，p-Smad1/5/8 和 p-Stat3 在 C57BL/6 小鼠肝組織中是下降的趨勢（p<0.05），與hepcidin 的變化趨勢一致，但在 Hfe-/-小鼠肝組織中的變化卻不明顯。p-Erk 在

圖 3.3 MC-LR 對鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因和蛋白的影響注：橫坐標(biāo)代表檢測的相關(guān)指標(biāo)，縱坐標(biāo)代表相對于對照組的相比比值。A、B、C、D分別代表 qPCR、蛋白定量、C57BL/6 小鼠和 Hfe-/-小鼠的蛋白條帶結(jié)果。a、b、c、d 在 A、B 中分別代表雌性、雄性 C57BL/6 小鼠和雌雄、雄性 Hfe-/-小鼠。a、b 在 C、D 中分別代表小腸和肝臟的蛋白結(jié)果。*代表與對照組相比， p<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義3.3 MC-LR 對肝組織損傷及對心、肝、脾等組織細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果如圖 4A 所示，在 C57BL/6 小鼠對照組的肝組織中，只觀察到少量的肝細(xì)胞質(zhì)疏松（黑色箭頭），未觀察到其他異常的改變，，但隨著染毒劑量的升高，C57BL/6 小鼠肝組織的損傷情況是逐漸加重的，在 12.5 μg/kg MC-LR 組出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死和核破裂（紅色箭頭），在 25 μg/kg MC-LR 組出現(xiàn)明顯的病理改變，以膠原蛋白增生和肝細(xì)胞凋亡為特征。但在 Hfe-/-小鼠對照組中出現(xiàn)肝細(xì)胞輕微水腫、肝細(xì)胞腫脹、胞漿松染（黑色箭頭），在 25 μg/kg MC-LR 組中，肝細(xì)胞水腫、肝細(xì)胞腫脹和胞漿松染更加顯著（黑色箭頭），并且在血管周圍出現(xiàn)肝細(xì)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R114

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