發(fā)布時間：2020-04-21 22:40

【摘要】：目的:研究苯并芘(benzo[a]pyrene,BaP)對骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic proteins 2,BMP2)誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影響,并對其相關(guān)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步研究。方法:用腺病毒Ad-BMP2感染間充質(zhì)干細(xì)胞,RT-PCR檢測1d時BMP2及芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)的表達(dá)。隨后加入不同濃度BaP處理,檢測BaP對BMP2誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響:通過檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的染色和活性測定其對BMP2誘導(dǎo)成骨分化早期的影響,檢測茜素紅S染色觀察其對BMP2誘導(dǎo)的成骨分化晚期的影響。Western blot檢測Runx2,OCN,OPN和BMP/Smad信號通路中p-Smad1/5/8的表達(dá)。應(yīng)用AhR拮抗劑CH223191后,觀察其對上述成骨分化指標(biāo)及BMP/Smad信號通路的影響。為進(jìn)一步明確其具體機(jī)制,用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)BMPRⅡ和Hey1為苯并芘的靶基因,用RT-q PCR檢測苯并芘對BMPRⅡ和Hey1的調(diào)控,用Western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測BMPRⅡ的蛋白表達(dá)水平,應(yīng)用AhR拮抗劑CH223191后,檢測BMPRⅡ和Hey1的變化。結(jié)果:用腺病毒Ad-BMP2感染間充質(zhì)干細(xì)胞時,BMP2的表達(dá)水平顯著增高,AhR的表達(dá)則無顯著差異。不同濃度的BaP處理感染Ad-BMP2的間充質(zhì)干細(xì)胞后,BaP可以劑量依賴的方式抑制BMP2誘導(dǎo)的ALP活性、鈣鹽沉積;qRT-PCR結(jié)果顯示BaP可以劑量依賴的方式抑制BMP2誘導(dǎo)成骨相關(guān)基因Runx2,ALP和OSX的表達(dá)。Western Blot檢測結(jié)果顯示BaP可以劑量依賴的方式抑制BMP2誘導(dǎo)的Runx2、OCN、OPN及p-Smad1/5/8的表達(dá)。應(yīng)用AhR拮抗劑CH223191后,其可部分逆轉(zhuǎn)BaP對BMP2誘導(dǎo)的間充干細(xì)胞早晚期成骨分化及BMP2/Smad信號通路的抑制作用。BaP抑制BMPRⅡ的蛋白水平的表達(dá),并上調(diào)Hey1的表達(dá),CH223191可以逆轉(zhuǎn)BaP對BMPRⅡ表達(dá)的抑制作用,并抑制BaP對Hey1的激活作用。結(jié)論:BaP可通過AhR抑制BMP2介導(dǎo)的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,其作用機(jī)制可能是通過Ah R抑制BMPRⅡ表達(dá),同時激活Hey1增強(qiáng)其對BMP2負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,從而影響B(tài)MP/Smad信號通路的激活。
【圖文】：

level of BMP2 of B. D: The relative mRNA level of AhR of B. E: Ad-GFP and Ad-BMP2 infectedMEFs for 48h. F and G: the gene expression level of BMP2 and AhR in MEFs that infectedAd-BMP2 for 48h by RT-qPCR. ***P<0.001, ns: no significant difference.2.2 BaP抑制BMP2誘導(dǎo)的MSCs早期成骨分化指標(biāo)ALPC3H10T1/2 細(xì)胞和 MEF 細(xì)胞在不感染或感染 Ad-BMP2 的情況下，分別給予不同濃度 BaP 處理，，C3H10T1/2 細(xì)胞處理 7d，MEF 細(xì)胞處理 5d。結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨(dú)使用 BaP 處理后，ALP 染色和活性在 C3H10T1/2 細(xì)胞(圖 2A 和2B)和 MEF 細(xì)胞(圖 2C 和 2D)中明顯減弱，且有一定的劑量依賴性，這表明單獨(dú)BaP 可以劑量依賴的方式抑制 MSCs 的早期成骨分化指標(biāo) ALP；與對照組 BMP2組相比，BMP2 和 BaP 共同處理后，ALP 染色和活性在 C3H10T1/2 細(xì)胞(圖 2A 和2B)和MEF細(xì)胞(圖2C和2D)中明顯減弱，且有一定的劑量依賴性。該結(jié)果表明, BaP可以劑量依賴的方式抑制 BMP2 誘導(dǎo)的 MSCs 的早期成骨分化。

28圖 6CH223191可部分逆轉(zhuǎn)BaP對BMP2誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞的早期成骨分化的抑制作用Fig. 6 CH223191 can rescue the toxicologic effects of BaPon BMP2-induced the earlyoesteogenic differentiation of MSCsA: C3H10T1/2 細(xì)胞的 ALP 染色結(jié)果（7d）；B: ALP 活性；C: MEF 細(xì)胞的 ALP 染色結(jié)果（5d）；D: ALP 活性。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05VS BMP2 組；###P<0.001，#P<0.05 VS BMP2+BaP+DMSO 組。A: The result of ALP staining of C3H10T1/2cells (7d); B: ALP activity; C: The result of ALPstaining of MEFs (5d); D: ALP activity. ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05VS BMP2;###P<0.001,#P<0.05 VS BMP2+BaP+DMSO.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R114

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本文編號：2635822