【摘要】：多氯聯(lián)苯(PCBs)是一組持久性有機(jī)污染物和人類致癌物。PCBs雖被禁用多年,因其難降解性和新產(chǎn)生的污染,在環(huán)境中仍普遍存在并在局部地區(qū)呈現(xiàn)高度污染與人體暴露。PCBs依其兩個苯環(huán)的空間關(guān)系分為共平面(類二VA英)PCBs和非共平面(非二VA英)PCBs。前者毒性主要經(jīng)激活芳香烴受體(aromatic hydrocarbon receptor,AHR)而介導(dǎo),后者則主要通過代謝活化產(chǎn)物產(chǎn)生毒性。共平面PCBs不僅是CYP1酶強(qiáng)誘導(dǎo)劑,并且大鼠CYP1A與斑馬魚CYP1A1可轉(zhuǎn)化3,3',4,4'-四氯聯(lián)苯(PCB77)、3,3',4,4',5-五氯聯(lián)苯(PCB126)成4-羥基代謝產(chǎn)物。然而,其它CYP1酶對共平面PCBs代謝和活化能力尚不清楚。目的1.觀察不同共平面多氯聯(lián)苯(PCB 77、PCB 81、PCB 126)在人CYP1酶(CYP1A1、CYP1A2及CYP1B1)作用下對哺乳動物細(xì)胞的遺傳毒效應(yīng)。2.采用著絲粒蛋白B(CENP-B)免疫熒光顯色法,觀察所形成微核是否含有著絲粒,以判斷受試物誘發(fā)微核的形成機(jī)制(鑒別斷裂作用與致非整倍體作用)。方法1.細(xì)胞毒性(CCK-8)實(shí)驗(yàn)采用CCK-8實(shí)驗(yàn)分析受試物對中國倉鼠肺(V79)細(xì)胞、重組表達(dá)人CYP1A1、1A2、1B1的V79細(xì)胞、人肝癌(C3A)細(xì)胞系的毒性。2.微核實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)體外微核實(shí)驗(yàn)分析受試物對上述細(xì)胞系誘發(fā)微核效應(yīng),染毒/恢復(fù)時程分別為6 h/18 h與18 h/6 h兩種。3.Hprt致突變實(shí)驗(yàn)采用Hprt致突變實(shí)驗(yàn)檢測受試物誘發(fā)重組V79細(xì)胞基因突變效應(yīng)。4.有絲分裂指數(shù)和細(xì)胞周期分析受試物處理細(xì)胞后對細(xì)胞行固定與染色,采用光學(xué)顯微鏡分析用有絲分裂指數(shù)的變化,并將細(xì)胞用PI染色后用流式細(xì)胞術(shù)分析受試物對細(xì)胞周期的影響。5.免疫熒光法顯示微核著絲粒采用抗著絲粒蛋白B(centromere protein B,CENP-B)抗體以免疫熒光法檢測微核是否含有著絲粒。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用方差分析,微核實(shí)驗(yàn)和致突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)合并二個重復(fù)測定之后作卡方分析,而微核著絲粒檢測結(jié)果(n = 3)則采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果1.在5μmol/L～40μmol/L(接近溶解度)濃度三個共平面多氯聯(lián)苯(PCB 77、PCB 81、PCB 126)對V79-Mz細(xì)胞均不誘發(fā)微核。然而PCB 81在6h/18 h(暴露/恢復(fù)時程)處理?xiàng)l件下對 V79-hCYP1B1、V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2 細(xì)胞均引起微核細(xì)胞率增高;在另一處理?xiàng)l件(18 h/6 h)下則三個受試受均誘發(fā)V79-hCYP1A2細(xì)胞微核形成,而對其它細(xì)胞系無作用。2.三個受試物在標(biāo)準(zhǔn)的Hprt致突變實(shí)驗(yàn)條件下對所有細(xì)胞系(V79-Mz、V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP1B1)在受試濃度范圍(5μmol/L～40μmol/L)均未顯示致突變作用(反應(yīng)為陰性)。同時,作為實(shí)驗(yàn)的陽性對照苯并(a)芘(0.11μmol/L)(依賴CYP1A1和CYP1B1酶的間接致突變物)對V79-hCYP1A1和V79-hCYP1B1細(xì)胞系均誘導(dǎo)Hprt突變子顯著升高;同樣,黃曲霉毒素B1(依賴CYP1A2的間接致突變物)明顯升高V79-hCYP1A2細(xì)胞的突變頻率,說明受試的重組細(xì)胞表達(dá)的代謝酶具有相應(yīng)的代謝功能,亦即這些細(xì)胞系對受試共平面PCBs的陰性結(jié)果有效。3.以PCB 81為代表性共平面多氯聯(lián)苯化合物,采用抗CENP-B抗體免疫熒光法顯示,PCB 81在6 h/18 h和18 h/6 h暴露條件下對V79-CYP1B1細(xì)胞誘發(fā)的微核均以CENP-B陰性者為主,分別占74%和65%。同時,已知斷裂劑乙基甲基磺酸酯和致非整倍體劑長春新堿在該實(shí)驗(yàn)中誘發(fā)的微核著絲粒陽性率分別為22%和61%,與既往報道相符,說明將抗CENP-B抗體用于以免疫熒光法分析微核著絲粒的實(shí)驗(yàn)(作為經(jīng)典的CREST實(shí)驗(yàn)的替代方法)是有效的。結(jié)論三個受試物在不同暴露時程下可被人CYP1B1、CYP1A2、CYP1A1活化為具有誘發(fā)細(xì)胞微核作用的代謝物;其中以CYP1B1對PCB81的作用最明顯,其誘發(fā)微核機(jī)制為斷裂作用。三個受試物對上述表達(dá)人CYP1酶的重組V79細(xì)胞均無誘發(fā)Hprt基因突變的作用。綜上,受試的三個共平面PCBs在細(xì)胞內(nèi)CYP1酶的代謝活化作用下可呈現(xiàn)強(qiáng)度與實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)有限的遺傳毒作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2624792