【摘要】：矽肺(又稱硅肺),是由于長期吸入大量含有游離二氧化硅(silicon dioxide,SiO_2)粉塵所引起的以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主的慢性進(jìn)行性職業(yè)病。矽肺目前已經(jīng)成為我國重大的職業(yè)衛(wèi)生安全問題之一。研究矽肺的發(fā)生、發(fā)展機制,探求有效的治療靶點一直是世界范圍內(nèi)職業(yè)病研究領(lǐng)域的難點和熱點問題。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞被認(rèn)為是肺泡的“防御細(xì)胞”,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的功能狀態(tài)是決定肺損傷病理轉(zhuǎn)歸的決定因素之一。然而,矽肺纖維化過程中,SiO_2刺激對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷作用及其機制仍需進(jìn)一步的深入研究與探討。N-乙酰-絲氨酰-天門冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline,Ac-SDKP)一種具有生理活性的內(nèi)源性四肽。研究發(fā)現(xiàn),Ac-SDKP在其基礎(chǔ)分泌水平就有抑制器官內(nèi)膠原積聚的重要作用。課題組前期研究結(jié)果顯示,Ac-SDKP可通過抑制成纖維細(xì)胞增殖以及肌成纖維細(xì)胞分化進(jìn)而發(fā)揮抗矽肺纖維化的作用。本研究擬探討SiO_2對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的刺激作用及其機制,進(jìn)一步觀察Ac-SDKP能否通過抑制SiO_2誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮抗矽肺纖維化作用,探討Ac-SDKP抗矽肺纖維化作用的分子機制。研究共分為三個部分:第一部分SiO_2對人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的刺激作用及其機制目的:以人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549為研究對象,觀察與分析SiO_2對人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的刺激作用及其機制方法:1將人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549分為:1)對照組;2)SiO_2(50μg/cm~2)刺激組。2采用透射電鏡觀察比較正常對照組及SiO_2刺激組A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變及凋亡現(xiàn)象的產(chǎn)生。3提取對照組及SiO_2刺激組蛋白樣品,經(jīng)雙向凝膠電泳分離后采用考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白點,用ImageMaster 6.0圖像分析軟件對凝膠進(jìn)行分析,篩選出差異蛋白。以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)獲得肽質(zhì)量指紋譜并對蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。4采用Western blot檢測A549細(xì)胞中GRP78、CHOP以及Caspase-12的蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.透射電鏡觀察,可見對照組A549細(xì)胞細(xì)胞膜表面完整,可見微絨毛,胞質(zhì)密度均勻,無空泡,細(xì)胞器完整,染色質(zhì)均勻,核仁清晰。SiO_2刺激組A549細(xì)胞,細(xì)胞表面微絨毛減少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,胞漿空泡化,核固縮,染色質(zhì)高度濃縮向核膜邊集。2.經(jīng)蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出的差異蛋白點中,與對照組相比,SiO_2刺激組有5個蛋白點表達(dá)上調(diào),6個蛋白點表達(dá)下調(diào)。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白——GRP78表達(dá)上調(diào)。3.Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,SiO_2刺激3 h后,GRP78蛋白水平顯著增加(P0.01)。CHOP和Caspase-12蛋白水平在SiO_2刺激6 h至48h之內(nèi)持續(xù)增加,具有時間依賴性(P0.01)。第二部分Ac-SDKP對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)在抑制二氧化硅誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡中的作用及其機制目的:以人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549為研究對象,觀察Ac-SDKP對SiO_2誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用,探討Ac-SDKP抑制SiO_2誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的作用機理。方法:1將人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549分為:1)對照組;2)SiO_2(50μg/cm~2)刺激組;3)4-PBA(0.5mmol/L)處理組4)Ac-SDKP(10~(-8)mol/L)處理組。2采用透射電鏡觀察Ac-SDKP及4-PBA對SiO_2刺激的A549細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。3采用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI染色法檢測Ac-SDKP及4-PBA對SiO_2刺激的A549細(xì)胞凋亡的影響。4免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測Ac-SDKP及4-PBA對SiO_2刺激的A549細(xì)胞GRP78、CHOP以及Caspase-12蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。5采用Western blot法檢測Ac-SDKP及4-PBA對SiO_2刺激的A549細(xì)胞GRP78、phospho-PERK、phospho-eIF2α、CHOP以及Caspase-12蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1.透射電鏡觀察可見,Ac-SDKP、4-PBA的預(yù)處理顯著改善了Si O_2誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張程度,無明顯胞漿空泡化,核固縮以及染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象。2.流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果顯示,與對照組相比,Si O_2刺激后的細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡/壞死細(xì)胞比例明顯高于對照組,Ac-SDKP、4-PBA的預(yù)處理顯著降低了SiO_2誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。Ac-SDKP處理組和4-PBA處理組細(xì)胞早期凋亡率分別為9.01%和9.52%,晚期凋亡/壞死細(xì)胞比例分別為3.09%和3.75%。3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,與對照組相比,SiO_2刺激48h后,GRP78、CHOP和Caspase-12陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多,GRP78主要表達(dá)于胞漿內(nèi),CHOP及Caspase-12蛋白在細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)。與SiO_2刺激組相比,Ac-SDKP處理組以及4-PBA處理組GRP78、CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞顯著減少。4.Western blot結(jié)果顯示,與正常對照組相比,Si O_2刺激組GRP78、phospho-PERK、phospho-eIF2α、CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組,Ac-SDKP、4-PBA的預(yù)處理顯著降低了SiO_2誘導(dǎo)的GRP78、phospho-PERK、phospho-eIF2α、CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)水平。第三部分Ac-SDKP對矽肺大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機制目的:通過建立大鼠矽肺動物模型觀察矽肺纖維化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在介導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡中的作用,探討Ac-SDKP對矽肺大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機制。方法:1大鼠矽肺模型的建立:采用HOPE-MED8050動式染塵控制系統(tǒng)構(gòu)建大鼠矽肺模型。動物隨機分為對照組及染塵4周、8周、12周、16周、24周、32周組,每組10只。染塵4周、8周、12周、16周組動物染塵至相應(yīng)時段處死,24周、32周組動物染塵16周后,轉(zhuǎn)為常規(guī)條件喂養(yǎng)直至第24周、32周進(jìn)行處死(模仿矽肺患者脫離染塵環(huán)境后矽肺的發(fā)生進(jìn)展情況)。2采用H.E染色、Masson染色法觀察不同染塵時間點,肺組織病理形態(tài)的改變,分別采用免疫組織化學(xué)法、Western blot法檢測SP-D、GRP78、CHOP、Caspase-12、phospho-PERK、phospho-eIF2α和I型膠原的蛋白表達(dá)及定位。3根據(jù)大鼠矽肺模型制備結(jié)果,于染塵16周時將動物隨機分為1)對照32周組;2)矽肺模型32周組;3)Ac-SDKP治療組;4)4-PBA治療組。4采用H.E染色、V.G染色法觀察Ac-SDKP及4-PBA對大鼠肺組織病理形態(tài)改變的影響。5采用Western blot法檢測SP-D、GRP78、CHOP、Caspase-12、phospho-PERK、phospho-eIF2α和I型膠原的蛋白表達(dá)變化。6采用透射電鏡觀察Ac-SDKP及4-PBA對矽肺大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。7采用免疫熒光染色法檢測大鼠肺組織SP-D/GRP78及SP-D/Caspase-12的共表達(dá)情況。結(jié)果:1.H.E、Masson染色結(jié)果顯示,對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,無明顯炎細(xì)胞浸潤。染塵4周可見巨噬細(xì)胞進(jìn)入肺泡腔內(nèi);染塵8周時,肺內(nèi)可出現(xiàn)多個細(xì)胞性結(jié)節(jié)融合成較大的單個矽結(jié)節(jié);染塵16周時可出現(xiàn)多個融合的矽結(jié)節(jié);染塵24周時細(xì)胞纖維性結(jié)節(jié)形成,至染塵32周時結(jié)節(jié)區(qū)域面積可達(dá)50%左右。2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,染塵4周和8周大鼠肺組織內(nèi)SP-D、GRP78,CHOP以及Caspase-12陽性表達(dá)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組,染塵12周后,SP-D陽性細(xì)胞開始減少。GRP78陽性細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加直至染塵的第24周,24周后GRP78陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化。CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)隨著染塵時間的延續(xù)持續(xù)增加。Western blot蛋白定量結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果相一致。此外,Western blot蛋白定量結(jié)果還顯示隨著染塵時間的延長phospho-PERK、phospho-eIF2α表達(dá)持續(xù)增加。3.H.E、V.G染色結(jié)果顯示,Ac-SDKP和4-PBA能夠減小矽肺大鼠肺組織矽結(jié)節(jié)面積,減輕了肺內(nèi)纖維化程度。4.透射電鏡觀察可見,Ac-SDKP、4-PBA顯著減輕了SiO_2誘導(dǎo)的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張程度,無明顯胞漿空泡化,核固縮以及染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象。5.Western blot結(jié)果顯示,Ac-SDKP和4-PBA減輕了大鼠肺組織SP-D、GRP78、CHOP、Caspase-12、phosphor-PERK、phosphor-eIF2α和I型膠原的蛋白表達(dá)。結(jié)論1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了SiO_2粉塵刺激誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡。2.Ac-SDKP可通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的Caspase-12和PERK/eIF2α/CHOP通路的激活而抑制Si O_2誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

圖 1 A549 細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察（紅色箭頭顯示擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，黃色箭頭顯示濃縮并邊集的染色質(zhì)）Fig.1 Ultrastructural observation of A549 cells under TEM (the red aindicates the dilated endoplasmic reticula and the yellow arrow indicathighly condensed chromatin).

圖 1 A549 細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察（紅色箭頭顯示擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，黃色箭頭顯示濃縮并邊集的染色質(zhì)）Fig.1 Ultrastructural observation of A549 cells under TEM (the red arrowindicates the dilated endoplasmic reticula and the yellow arrow indicates thehighly condensed chromatin).
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R135.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2624171