【摘要】：本研究以大鼠離體心臟和人源心肌細(xì)胞為研究對象,觀察鄰苯二甲酸單乙基己基酯(MEHP)對心肌細(xì)胞的損傷作用,并進(jìn)一步探究氧化應(yīng)激和轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a在MEHP所致心肌細(xì)胞損傷中的作用。第一部分:MEHP對心肌的損傷作用及氧化應(yīng)激在其中的作用研究目的:以大鼠離體心臟和人源心肌細(xì)胞為研究對象,觀察MEHP對心肌細(xì)胞的損傷作用,并進(jìn)一步探究氧化應(yīng)激在MEHP所致心肌細(xì)胞損傷中的作用。方法:1.利用離體心臟灌流技術(shù)測定MEHP對大鼠離體心臟的損傷。2.細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞模型建立。3.利用MTT實驗檢測細(xì)胞存活率,DCFH-DA探針標(biāo)記測定AC16細(xì)胞內(nèi)和離體心臟心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平,SCGE實驗測定細(xì)胞DNA損傷情況,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,全自動生化分析儀檢測細(xì)胞上清液和心臟灌流液中LDH含量,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位,大鼠離體心臟固定、包埋及染色后在顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。結(jié)果:1.MEHP可降低大鼠離體心臟左心室收縮及舒張功能、引起心率下降、大鼠心肌細(xì)胞膜受損、細(xì)胞ROS水平升高并可導(dǎo)致大鼠離體心臟組織發(fā)生病理學(xué)改變。2.MEHP引起AC16細(xì)胞存活率下降、細(xì)胞膜的毒性損傷、ROS水平升高、線粒體膜電位降低、DNA損傷、細(xì)胞凋亡率增加。3.抗氧化劑NAC可減弱MEHP所致的心臟損傷。4.NAC可減弱MEHP引起的AC16細(xì)胞的毒性損傷。第二部分:FOXO3a在MEHP所致AC16細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡中的作用目的:觀察FOXO3a在MEHP所致AC16細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡損傷中的作用。方法:1.利用免疫熒光技術(shù)對FOXO3a和P-FOXO3a蛋白在細(xì)胞中表達(dá)及核轉(zhuǎn)位情況進(jìn)行觀察。2.Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染FOXO3a TM或si RNA FOXO3a建立FOXO3a高、低表達(dá)細(xì)胞株,并對FOXO3a高、低表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。3.運用流式細(xì)胞儀檢測FOXO3a高、低表達(dá)細(xì)胞株經(jīng)MEHP處理后ROS水平和細(xì)胞凋亡的變化。4.熒光定量PCR及Western blot測定單純MEHP處理組、FOXO3a高、低表達(dá)細(xì)胞株經(jīng)MEHP處理組細(xì)胞中FOXO3a、Mn-SOD、ARC的mRNA及蛋白表達(dá)情況的變化。結(jié)果:1.MEHP處理后AC16細(xì)胞中FOXO3a、Mn-SOD、ARC mRNA及蛋白表達(dá)升高,P-FOXO3a蛋白表達(dá)下降。2.經(jīng)PCR和western鑒定,FOXO3a高、低表達(dá)細(xì)胞株建立成功。3.FOXO3a高表達(dá)后經(jīng)MEHP處理的AC16細(xì)胞與空質(zhì)粒MEHP處理的AC16細(xì)胞相比,ROS水平降低,細(xì)胞凋亡率下降,FOXO3a、Mn-SOD和ARC mRNA及蛋白進(jìn)一步升高。4.FOXO3a低表達(dá)后經(jīng)MEHP處理的AC16細(xì)胞與siRNA Control MEHP處理的AC16細(xì)胞相比,ROS水平升高,細(xì)胞凋亡率升高,FOXO3a、Mn-SOD、ARC mRNA及蛋白表達(dá)下降,但與FOXO3a低表達(dá)對照組相比FOXO3a、Mn-SOD、ARC mRNA及蛋白表達(dá)未發(fā)生明顯變化。結(jié)論1.MEHP對離體大鼠心臟和人源心肌AC16細(xì)胞具有明顯的損傷作用。2.氧化應(yīng)激參與MEHP所致的心肌細(xì)胞損傷。3.FOXO3a參與調(diào)控MEHP所致的AC16細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡損傷。
【圖文】：

22圖 1 MEHP 對左心室心肌收縮力（LVP）的影響1 Effect of MEHP on Left ventricular myocardial contractilit

圖 1-3 MEHP 對大鼠離體心臟心率的影響Fig.1-3 MEHP rat heart rate in vitro heartCompared with the corresponding 0 min: *P<0.05
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2623786