發(fā)布時(shí)間：2020-04-09 09:23

【摘要】：食源性多肽是指通過降解食源性蛋白,并經(jīng)分離純化獲得的小分子肽段。近年來,食源性多肽由于其降血壓、降血脂以及抗菌等生物學(xué)活性受到廣泛關(guān)注,但其在促皮膚細(xì)胞遷移及加快傷口愈合等方面的研究較少。鑒于此,在本論文中,我們開展了蛋清粉多肽促進(jìn)皮膚細(xì)胞遷移和創(chuàng)面愈合的作用和調(diào)控機(jī)制的研究。課題組在前期研究中,采用分步酶解法對(duì)蛋清粉進(jìn)行酶解,并通過超濾及葡聚糖凝膠純化,分離得到了四個(gè)混合多肽組分,分別命名為EWP1、EWP2、EWP3和EWP4。在本研究中,我們首先通過小室遷移(Transwell)實(shí)驗(yàn)對(duì)四個(gè)組分進(jìn)行篩選,結(jié)果顯示EWP2組分與其他三個(gè)組分相比具有明顯的促細(xì)胞遷移作用,我們通過小鼠皮膚創(chuàng)傷模型進(jìn)一步證實(shí)EWP2組分可以顯著促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合。我們通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)對(duì)EWP2組份進(jìn)行分析,得到了22條高豐度小肽序列。我們分兩批次隨機(jī)選取了10條小肽序列進(jìn)行合成。第一批次共選取四條小肽序列,包括KPHAEVVLR、KVEQGASVDKR、ADQARELIN和VNAIVFK,考察這些小肽對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞HSF的作用和調(diào)控機(jī)制。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KPHAEVVLR與其他三條小肽相比能夠有效地促進(jìn)HSF細(xì)胞遷移,MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KPHAEVVLR可促進(jìn)HSF細(xì)胞增殖。我們進(jìn)一步通過免疫熒光和免疫印跡實(shí)驗(yàn),考察KPHAEVVLR促HSF細(xì)胞遷移和增值的作用機(jī)制,結(jié)果表明KPHAEVVLR可以提高膜結(jié)合型Hsp90α的蛋白水平。第二批次共選取六條小肽序列,包括GASVDKR、DKEGKDVL、RVTEQESKPV、INFEKL、LYAEER和LRDILN。以人角質(zhì)形成細(xì)胞Ha Ca T為模型,考察這些合成小肽的促遷移作用。Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和MTS實(shí)驗(yàn)證明小肽INFEKL能夠有效促進(jìn)Ha Ca T細(xì)胞遷移和增殖,免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示INFEKL可提高胞質(zhì)型Hsp90α蛋白水平,并增加培養(yǎng)基中的分泌型Hsp90α含量。我們進(jìn)一步通過小鼠皮膚創(chuàng)傷模型證實(shí)INFEKL可加速小鼠創(chuàng)面愈合,HE染色結(jié)果提示INFEKL可加快小鼠創(chuàng)面上皮化進(jìn)程。本研究創(chuàng)新性地證明蛋清源小分子肽可通過提高胞外或胞內(nèi)型Hsp90α蛋白水平促進(jìn)皮膚細(xì)胞遷移,加速小鼠皮膚創(chuàng)面愈合,表明食源性多肽在調(diào)控細(xì)胞遷移方面具有研究潛力和應(yīng)用價(jià)值,為開發(fā)新型促皮膚創(chuàng)面愈合類食源性小分子肽提供的研究思路和理論依據(jù)。
【圖文】：

同濃度的血清情況下都能觀察到細(xì)胞，而且在 10%的血清中細(xì)胞的形態(tài)更好，因此我們選擇時(shí)間為 48 h，，10%的血清濃度作為實(shí)驗(yàn)的條件。圖2.1 不同血清濃度以及遷移時(shí)間HSF的遷移效果2.4.2 篩選有效的促進(jìn)細(xì)胞遷移的混合多肽課題組在前期研究中，采用分步酶解法對(duì)蛋清粉進(jìn)行酶解，并通過超濾及葡聚糖凝膠純化，分離得到了四個(gè)混合多肽組分，分別命名為 EWP1、EWP2、EWP3和 EWP4。確定了 HSF 細(xì)胞的 Transwell 實(shí)驗(yàn)條件后，我們選擇相同的多肽濃度200 μg/mL，探究 EWP1、EWP2、EWP3 和 EWP4 四個(gè)組分對(duì)于 HSF 細(xì)胞遷移的影響。加藥處理 48 h 后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定染色，而后用熒光顯微鏡拍照保存，整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果如圖 2.2 所示，相同濃度多肽的作用下，與對(duì)照組以及其余三組相比，組份 EWP2 明顯增加了穿過小室底部的細(xì)胞數(shù)量。因此

圖 2.2 不同多肽組份對(duì) HSF 細(xì)胞遷移的作用圖 2.3 不同濃度的 EWP2 對(duì) HSF 細(xì)胞遷移的作用2.4.3 動(dòng)物創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明酶解得到的混合多肽組份 EWP2 能夠明顯促進(jìn) HSF 細(xì)胞的遷移，因此我們選擇 EWP2 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在皮膚傷口愈合過程中，HSF 細(xì)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R151

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本文編號(hào)：2620578