發(fā)布時(shí)間：2020-04-07 23:03

【摘要】：1背景研究發(fā)現(xiàn),鎘會(huì)通過職業(yè)接觸、吸煙和食用受污染的水及食物等途徑暴露,引起肝臟、腎臟、肺臟、骨骼、大腦、生殖等多種器官及血液系統(tǒng)的損害甚至致癌。然而,鎘的毒作用致癌分子機(jī)制目前尚不完全清楚。有研究認(rèn)為鎘可通過以下幾方面發(fā)揮作用:氧化應(yīng)激、抑制DNA損傷修復(fù)、DNA異常甲基化、抑制細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期調(diào)控、致多種基因異常表達(dá)、雌激素樣效應(yīng)、促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)、慢性炎癥刺激。LTBP2(Latent transforming growth factor-βbinding protein 2)是潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2,目前研究發(fā)現(xiàn)LTBP2與甲狀腺癌、肝癌、多器官腫瘤等腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但其與環(huán)境化學(xué)物損傷作用機(jī)制還未見報(bào)道,本文擬檢測(cè)氯化鎘致人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)急性損傷后LTBP2基因表達(dá)水平,并在LTBP2缺陷細(xì)胞模型上研究鎘致細(xì)胞急性損傷的變化,探討LTBP2基因在氯化鎘致?lián)p傷毒性中的機(jī)制。2目的2.1在本課題組前期建立的鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,檢測(cè)16HBE細(xì)胞生物信息。在不同惡轉(zhuǎn)代數(shù)的16HBE mRNA表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)LTBP2基因的差異化表達(dá),深入地查找LTBP2基因的位點(diǎn)和形態(tài)等生物學(xué)特性。2.2利用本課題組成功構(gòu)建的,鎘亞慢性染毒后的動(dòng)物模型,觀察LTBP2 mRNA在不同亞慢性染毒后組織(心、肝、腎、肺)中的表達(dá)規(guī)律,探討鎘致動(dòng)物損傷模型組織中LTBP2的作用。2.3在16HBE細(xì)胞經(jīng)氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化后的不同階段中驗(yàn)證LTBP2的差異表達(dá);在成功構(gòu)建LTBP2低表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株后,觀察LTBP2低表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞增殖等一般生物學(xué)特性的影響,研究LTBP2基因在鎘惡性轉(zhuǎn)化毒性中的作用。2.4 16HBE細(xì)胞經(jīng)不同濃度,不同時(shí)間氯化鎘染毒,檢測(cè)LTBP2 mRNA表達(dá)變化,并用不同濃度,不同時(shí)間的氯化鎘染毒LTBP2低表達(dá)細(xì)胞株,檢測(cè)細(xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、細(xì)胞氧化應(yīng)激等指標(biāo),研究LTBP2基因?qū)︽k致細(xì)胞急性毒性損傷的影響。3方法3.1采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)LTBP2基因的差異表達(dá),使用RNA干擾技術(shù)和慢病毒轉(zhuǎn)錄技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)LTBP2基因的細(xì)胞系,檢測(cè)一般生物學(xué)性狀的變化。通過MTT、CCK8、流式細(xì)胞術(shù)、彗星實(shí)驗(yàn)、色素C及氧化指標(biāo)試劑盒檢測(cè)LTBP2基因?qū)?xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、色素C含量、MDA含量、SOD活力等方面的影響。3.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 16.0軟件分析,計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)服從正態(tài)分布者,采用?x±s表示。每個(gè)樣本3個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。三組及以上組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(總體方差齊,進(jìn)一步通過SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較)或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)(總體方差不齊,進(jìn)一步通過Dunnett's T3檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較)。兩組獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)。氯化鎘劑量與相應(yīng)指標(biāo)的關(guān)系采用一元線性回歸分析,以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。4結(jié)果4.1 LTBP2基因在鎘致16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá):qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞LTBP2基因表達(dá),惡性轉(zhuǎn)化前細(xì)胞(14 th)和惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞(35 th)中LTBP2 mRNA相對(duì)表達(dá)分別為2.04±0.36,5.93±0.60,與16HBE對(duì)照組相比,惡轉(zhuǎn)前細(xì)胞和惡轉(zhuǎn)細(xì)胞分別增加2.04倍和5.93倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.2 LTBP2在亞慢性染毒大鼠組織中的表達(dá)情況:通過亞慢性鎘染毒大鼠模型,發(fā)現(xiàn)LTBP2在肺、心、肝各組織表達(dá)增加,肺組織低、中、高劑量染毒組LTBP2基因的表達(dá)量分別為1.98±0.15、1.40±0.26、1.32±0.10,與對(duì)照組相比表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);LTBP2在心臟組織不同染毒組中的表達(dá)量分別為1.16±0.16、1.97±0.19、2.02±0.13,中高劑量組與對(duì)照組相比,表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);肝臟組織LTBP2表達(dá)量分別為1.33±0.35、1.22±0.25、1.19±0.10,各組無明顯差異(P0.05);腎臟組織低、中、高染毒組分別0.15±0.03、0.70±0.16、0.88±0.10,與對(duì)照組比較,低劑量組和中劑量組表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。在染毒大鼠中,氯化鎘染毒刺激肺、心、肝組織中LTBP2 mRNA表達(dá),特別在心臟組織中,高劑量染毒組LTBP2 mRNA表達(dá)量最高。在肺組織中,LTBP2隨著染毒劑量的增加而下降,存在劑量-反應(yīng)關(guān)系。4.3 LTBP2在鎘致16HBE急性損傷中的表達(dá)水平:16HBE細(xì)胞經(jīng)10、20、30、40μmol/L CdCl_2分別處理24 h,采用qRT-PCR測(cè)定LTBP2基因相對(duì)表達(dá)。與CdCl_2未染毒細(xì)胞相比,有顯著性差異(P0.05)。隨著氯化鎘染毒劑量的上升,LTBP2mRNA表達(dá)逐漸升高,變化趨勢(shì)呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P0.01)。用30μmol/L CdCl_2分別處理16HBE細(xì)胞12、24、48 h,與CdCl_2未染毒細(xì)胞相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨著染毒時(shí)間的增加,LTBP2 mRNA表達(dá)逐漸升高,變化趨勢(shì)呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系(P0.01)。4.4 LTBP2低表達(dá)對(duì)一般生物學(xué)性狀的影響:采用慢病毒載體介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染,成功構(gòu)建了LTBP2低表達(dá)細(xì)胞株:16HBE-shLTBP2細(xì)胞,LTBP2低表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增殖率無明顯影響。4.5 LTBP2低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的作用:16HBE細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl_2分別處理24 h,細(xì)胞抑制率逐漸升高,變化趨勢(shì)呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P0.01)。與16HBE相比,相同濃度CdCl_2處理的16HBE-shLTBP2抑制率顯著降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。用30μmol/L氯化鎘處理16HBE及16HBE-shLTBP2細(xì)胞不同時(shí)間,在24、48、72 h,與16HBE相比,相同時(shí)間處理的16HBE-shLTBP2細(xì)胞抑制率顯著降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.6 LTBP2低表達(dá)對(duì)色素C含量的影響:利用細(xì)胞色素C試劑盒檢測(cè)16HBE細(xì)胞急性染毒模型對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。用30μmol/L CdCl_2處理細(xì)胞12、24、48、72 h,在12,48,72 h時(shí),16HBE-shLTBP2的色素C濃度顯著高于16HBE(P0.05)。用10、20、30、40μmol/L CdCl_2處理16HBE細(xì)胞24 h時(shí),在10、20、40μmol/L時(shí),16HBE-shLTBP2的色素C濃度顯著高于16HBE(P0.05)。4.7 LTBP2低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞氧化損傷的作用:不同濃度CdCl_2處理16HBE及LTBP2低表達(dá)細(xì)胞株16HBE-shLTBP2細(xì)胞不同時(shí)間,與16HBE相比,CdCl_2處理的16HBE-shLTBP2 SOD活力顯著升高(P0.01)。而與16HBE相比,CdCl_2處理的16HBE-shLTBP2 MDA含量顯著降低(P0.05)。4.8 LTBP2低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞凋亡的影響:分別用不同濃度(10、20、30、40μmol/L)、不同時(shí)間(12、24、48和72 h)CdCl_2處理LTBP2系列細(xì)胞株,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。在24 h CdCl_2處理模型中16HBE-shLTBP2細(xì)胞的凋亡率均高于同處理組正常16HBE細(xì)胞;在30μmol/L CdCl_2處理不同時(shí)間模型中也發(fā)現(xiàn)16HBE-shLTBP2細(xì)胞的凋亡率均高于對(duì)照細(xì)胞。4.9 LTBP2低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞DNA損傷的作用:不同濃度鎘染毒細(xì)胞時(shí),對(duì)于16HBE-shLTBP2組,TL、TD(%)、TM和OTM值4個(gè)損傷指標(biāo)均隨著其染毒濃度上升增大。在各個(gè)染毒濃度,16HBE-shLTBP2組與同組16HBE細(xì)胞相比,其4項(xiàng)損傷值均明顯高于16HBE細(xì)胞組,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在30μmol/LCdCl_2處理下,在12、24、48 h染毒時(shí)間組,16HBE-shLTBP2組的4項(xiàng)損傷指標(biāo)均與16HBE組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在72 h染毒時(shí)間組,兩組細(xì)胞間的4項(xiàng)損傷指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5結(jié)論5.1在鎘致16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞、亞慢性染毒大鼠組織中及不同劑量、不同時(shí)間CdCl_2的急性染毒過程中,LTBP2基因隨著染毒劑量或惡轉(zhuǎn)程度的增加表達(dá)升高,存在明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系,提示LTBP2基因參與鎘引起的急性損傷、亞慢性毒作用,以及惡性轉(zhuǎn)化過程。5.2成功構(gòu)建了LTBP2低表達(dá)細(xì)胞株。經(jīng)CdCl_2處理,與16HBE相比,16HBE-shLTBP2的細(xì)胞抑制率、MDA含量降低,SOD含量增加,提示LTBP2基因可能通過氧化應(yīng)激通道參與鎘對(duì)細(xì)胞急性損傷的過程;16HBE的凋亡率,DNA損傷程度均低于16HBE-shLTBP2,提示LTBP2在鎘致細(xì)胞急性損傷過程中可能抑制細(xì)胞凋亡并參與DNA損傷過程。
【圖文】：

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果2.1 LTBP2 基因在鎘致 16HBE 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程、亞慢性染毒大鼠組織及急性染毒中的表達(dá)2.1.1 LTBP2 基因的定位在 NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）上搜索 LTBP2 在人類基因組中的定位和保守型。Latent transforming growth factor beta binding protein 2（LTBP2）基因位于14q24.3染色體上，處于74,498,183-74,618,609位點(diǎn)之間，全長(zhǎng)有120247bp，外顯子共有 36 個(gè)，是蛋白編碼基因。

注：與對(duì)照組相比，** P<0.01，*P<0.05圖 2-2 LTBP2 在鎘致 16HBE 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的表達(dá)Expression of LTBP2 in cadmium induced malignant transformation of 在亞慢性染毒大鼠組織中的表達(dá)情況性鎘染毒大鼠模型，發(fā)現(xiàn) LTBP2 在肺、心、肝各組織中高劑量染毒組 LTBP2 mRNA 相對(duì)表達(dá)分別為 1.98 0.15與對(duì)照組相比，表達(dá)增高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），組 LTBP2 mRNA 相對(duì)表達(dá)分別為 1.16 0.16、1.97 0.19對(duì)照組相比，表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；肝表達(dá)分別為 1.33 0.35、1.22 0.25、1.19 0.10，各組無明顯中、高染毒組分別 0.15 0.03 、0.70 0.16 、0.88 0.10和中劑量組表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在激肺、心、肝組織中 LTBP2 mRNA 表達(dá)，，特別在心臟組
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2618504