【摘要】：目的1建立矽肺大鼠模型及體外染塵細胞模型,證實二氧化硅(SiO2)粉塵可以誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的激活。2探討能否通過抑制SiO2誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激降低矽肺發(fā)生發(fā)展過程中的自噬水平。3探討骨髓間充干細胞條件培養(yǎng)基(Bone Marrow Stem Cell Conditioning Medium,BMSCs-CM)是否能夠通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來抑制自噬的發(fā)生,延緩矽肺進程。方法:本研究將分為體內(nèi)、外實驗兩個部分開展,分別從動物以及細胞領(lǐng)域進行探討研究。1體內(nèi)實驗動物分組及模型制備:45只成年雄性SD大鼠,隨機分成3組:對照組,模型組,IRE1抑制劑組,每組15只。模型組、IRE1抑制劑組采用非暴露式氣管插管一次性灌注SiO2粉塵混懸液(50g/L)建立矽肺大鼠模型,對照組注入等量滅菌NaCl。IRE1抑制劑組大鼠通過腹腔注射方式給予STF083010(1.0mg/kg),每3天注射一次,余兩組等量滅菌NaCl處理。各組于造模3、7、14天分批處死5只大鼠。檢測方法:肺組織蘇木素—伊紅(HE)染色驗證造模是否成功。肺泡巨噬細胞(Alveolar macrophage,AM)HE染色觀察其形態(tài)學改變;免疫印跡法檢測IRE1、LC-3、Beclin-1蛋白的表達情況;免疫熒光法檢測IRE1、LC-3蛋白在AM中定位。2體外實驗動物分組及模型制備:選取約4周齡、質(zhì)量約110g的SPF級雄性SD大鼠作為提取BMSCs的動物供體。另取50只SPF級健康成年雄性SD大鼠獲取AM,將AM分為4組:對照組僅加入無血清培養(yǎng)液,處理組加入SiO2粉塵懸液(50μg/ml)建立體外矽肺模型。IRE1抑制劑組加入40μmol/L的STF-083010試劑,BMSCs-CM組加入等體積已制備好的條件培養(yǎng)液。各實驗組完成相應的實驗處理后分為6h、12h、18h、24h、36h。免疫印跡法檢測GRP78、IRE1、LC-3、Beclin-1表達量。計算結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義用P0.05表示。結(jié)果:1形態(tài)學觀察貼壁后原代BMSCs細胞體積小,呈圓形或扁圓形,平形狀或漩渦狀排列生長,第三代BMSCs形態(tài)更趨于均一,鏡下觀察如成纖維細胞樣,核清晰,胞漿豐富。2肺組織形態(tài)學結(jié)果:對照組大鼠肺泡壁薄,組織結(jié)構(gòu)清晰,間質(zhì)均勻透亮。模型組大鼠3d時可見浸潤的炎性細胞,肺泡腔少有漿液性滲出,肺泡間隔增厚,水腫不明顯。7d時肺泡間隔明顯增寬變厚,肺間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)以肺泡巨噬細胞為主的炎性浸潤。14d時肺泡間隔增厚明顯,肺組織結(jié)構(gòu)不清,出現(xiàn)大量纖維組織增生,有矽結(jié)節(jié)形成。3 AM的形態(tài)學觀察結(jié)果:對照組貼壁后的AM細胞呈扁圓形或球形,核質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰。與對照組相比,矽肺模型組AM體積增大,分布生長不均一,部分細胞核表現(xiàn)為單側(cè)分布,胞質(zhì)疏松,胞內(nèi)可見點樣硅塵晶體。BMSCs-CM組AM生長優(yōu)于矽肺模型組,多數(shù)細胞的形態(tài)規(guī)則,核質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰。4Western blot檢測結(jié)果:體內(nèi)實驗結(jié)果顯示對照組IRE1、LC-3、Beclin-1蛋白呈基礎(chǔ)表達,各時間點表達無明顯變化;矽肺模型組比較對照組各蛋白表達量在7d、14d明顯高于同期對照組(P0.05),隨時間成增量表達。體外實驗結(jié)果顯示IRE1、GRP78、LC-3、Beclin-1蛋白在對照組中僅有基礎(chǔ)表達,各時間點無明顯變化,矽肺模型組各蛋白表達量在6h后隨時間延長逐漸增高,直至18h達高峰,高于同期對照組基礎(chǔ)表達(P0.05)。相比矽肺模型組,IRE1抑制劑組、BMSCsCM組的各蛋白在各時間表達顯著下降(P0.05),BMSCs-CM組與IRE1抑制劑組相比各蛋白表達差異不大,總體趨勢相似。免疫熒光結(jié)果顯示在體內(nèi)實驗中IRE1、LC-3呈胞漿表達,3d、7d、14d不同時間點的對照組僅有基礎(chǔ)表達,相比同期,模型組IRE1、LC-3熒光明顯增強,抑制劑組比模型組IRE1、LC-3熒光表達減弱,隨時間呈動態(tài)變化。結(jié)論1硅塵顆�？烧T導大鼠肺泡巨噬細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。2 IRE1抑制劑STF083010能夠抑制矽肺大鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應,延緩其自噬過度激活效應;3 BMSCs-CM可阻斷大鼠肺泡巨噬細胞部分因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激效應發(fā)生的自噬激活,對矽肺大鼠肺泡巨噬細胞產(chǎn)生一定保護作用。
【圖文】：

細胞形態(tài)變得更加均勻、豐富，成梭形樣（圖1）。1.2.2 AM 的形態(tài)學觀察肺泡灌洗液中AM占絕大多數(shù)，其他非貼壁細胞經(jīng)離心，種植培養(yǎng)，換液后被去除，最終得到的AM細胞純度可在95%以上。鏡下觀察獲取的模型對照組AM呈卵圓形，部分未貼壁細胞體積偏小（圖2）。圖 1 倒置相差顯微鏡下 BMSCs 形態(tài)學觀察 ×200Fig.1 Cell morphology of BMSCs observed under inverted phase contrast microscope

未見硅沉著吞噬顆粒。模型組、IRE1抑制劑組AM體積較對照組增大，呈圓形或不規(guī)則形，胞核位于一側(cè)或中央，，可見散在的細顆粒物，點片狀細胞碎片（附圖3）圖 3 大鼠肺泡巨噬細胞 14d 形態(tài)學觀察×200 A.對照組；B.模型組；C.STF083010 干預組Fig.3 Morphological observation of rat alveolar macrophages for 14 days圖 2 倒置相差顯微鏡下 AM 形態(tài)學觀察 ×400Fig.2 AM morphology observation under inverted phase contrastmicroscope
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R135.2

【參考文獻】

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1 高俊玲;朱會興;趙曼;李冉;江小華;田艷霞;崔建忠;;BMSCs移植對矽肺大鼠肺泡巨噬細胞自噬活化的影響[J];中國民康醫(yī)學;2015年14期

本文編號：2618282