【摘要】：環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的污染及其對人類生殖系統(tǒng)的損害，已經(jīng)成為當(dāng)今環(huán)境衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。DEHP作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物在環(huán)境中廣泛存在，我國雖已將其列入優(yōu)先監(jiān)測環(huán)境污染物，但近年來的白酒塑化劑事件、聚氯乙烯保鮮膜和出口玩具DEHP超標(biāo)等一系列事件提示我國增塑劑污染問題嚴(yán)重，已引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。 目的： 從組織、細(xì)胞和分子水平系統(tǒng)的探討DEHP及MEHP對性激素分泌水平和顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，闡明DEHP和MEHP對雌性生殖器官和生殖功能的影響，以探討DEHP的生殖內(nèi)分泌干擾作用，為明確DEHP與雌性生殖內(nèi)分泌毒性的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，為全面評價(jià)DEHP的毒理學(xué)作用及其對人類生殖系統(tǒng)潛在危害提供科學(xué)依據(jù)。100LD_(50) 方法： 第一部分DEHP和MEHP的一般生殖毒性研究 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將48只成年雌性Wistar大鼠隨機(jī)排序分組法分為4個(gè)劑量組，即陰性對照組（玉米油）、低劑量組（300mg/kg/d，，1/）、中劑量組（1000mg/kg/d，1/30LD_(50)）、高劑量組（3000mg/kg/d，1/10LD_(50)），每組12只。每天灌胃1次，每周連續(xù)6天，共4周。觀察大鼠的一般生長狀況，記錄飲水量、攝食量及體重變化情況；處死前兩周，每天早6時(shí)和晚6時(shí)采用陰道脫落細(xì)胞涂片法觀察動(dòng)情周期變化，研究DEHP對動(dòng)情周期的影響；于動(dòng)情間期處死大鼠，大鼠眶內(nèi)取血，取子宮、卵巢組織，計(jì)算卵巢、子宮的臟器系數(shù)；HE染色法觀察大鼠卵巢、子宮病理組織變化；放射免疫分析法測定血清中FSH、LH等激素水平；免疫組織化學(xué)染色法測定卵巢、子宮組織FSH、LH激素受體表達(dá)情況。 2.體外實(shí)驗(yàn)：取21～29d齡未成年雌性Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，采用HE染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對所獲取的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，觀察細(xì)胞的一般生長狀況及性激素分泌情況，并采用MTT法測定生長曲線，放射免疫法測定培養(yǎng)基中P4和E2激素分泌水平。以DEHP主要代謝產(chǎn)物MEHP對顆粒細(xì)胞進(jìn)行染毒，染毒劑量分別為0（對照組）、25、50、100μmol/L。染毒結(jié)束后MTT法檢測細(xì)胞相對活力，放射免疫法測定培養(yǎng)基中P4和E2激素分泌水平，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測卵巢顆粒細(xì)胞FSH受體表達(dá)情況。 第二部分DEHP和MEHP對性激素合成通路基因及其受體表達(dá)的影響和機(jī)制 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物分組及染毒同第一部分，提取卵巢組織RNA，運(yùn)用RT-PCR法檢測大鼠卵巢性激素合成通路STAR、P_(450)scc、3β-HSD、17β-HSD Ι、17β-HSDII和P450arom基因表達(dá)差異，采用免疫組織化學(xué)法觀察卵巢、子宮組織性激素受體PR、ER的表達(dá)量。 2.體外實(shí)驗(yàn)：卵巢顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定方法及染毒同第一部分。運(yùn)用RT-PCR法檢測體外卵巢顆粒細(xì)胞性激素合成通路STAR、P450scc、3β-HSD、17β-HSD Ι、17β-HSD II和P_(450)arom基因表達(dá)差異，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察顆粒細(xì)胞性激素受體PR、ER的表達(dá)量。 第三部分DEHP和MEHP對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物分組及染毒同第一部分，分離卵巢顆粒細(xì)胞，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法觀察DEHP誘導(dǎo)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況，利用分光光度法檢測Caspase-3活性，Western Blot法測定凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)水平。 2.體外實(shí)驗(yàn)：卵巢顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定方法及染毒同第一部分。采用Annexin V-FITC/PI雙染法觀察MEHP誘導(dǎo)體外卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況，利用分光光度法檢測顆粒細(xì)胞Caspase-3活性，Western Blot法測定顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax，Bcl-2表達(dá)水平。 結(jié)果： 第一部分DEHP和MEHP的一般生殖毒性研究 1．經(jīng)DEHP灌胃染毒，染毒組雌性大鼠動(dòng)情后期、動(dòng)情間期及動(dòng)情周期持續(xù)時(shí)間與對照組比較明顯延長（P＜0.05）；各染毒組大鼠動(dòng)情前期和動(dòng)情期持續(xù)時(shí)間與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 2．各染毒組大鼠飲水量與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而DEHP染毒組大鼠攝食量與對照組比較逐漸增加（P＜0.05），但是染毒組大鼠體重與對照組比較明顯下降（P＜0.05）。 3．DEHP染毒組大鼠卵巢臟器系數(shù)與對照組比較明顯降低（P＜0.05），而各染毒組大鼠子宮臟器系數(shù)與對照組比較無明顯差異（P＞0.05）。對照組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，可見處于不同階段的卵泡，黃體、白體及卵巢間質(zhì)形態(tài)正常。DEHP染毒組大鼠卵巢卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞存在不同程度的損傷現(xiàn)象，出現(xiàn)彌漫性顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松、水腫、核固縮、核碎裂等病理變化；顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞間隙增寬；閉鎖卵泡明顯增多。對照組大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)未見異常，而染毒組大鼠子宮內(nèi)膜出現(xiàn)胞核假復(fù)層現(xiàn)象，上皮增生和內(nèi)皮纖維化，腔上皮細(xì)胞排列不整齊、疏松，細(xì)胞核大小不均；固有層腺體數(shù)目減少，部分腺體萎縮。 4．DEHP暴露大鼠血清FSH、LH、P4、T和E2激素分泌水平與對照組比較明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 5.與對照組比較，DEHP染毒組大鼠卵巢和子宮組織中免疫組織化學(xué)染色程度減弱，面積減小。半定量分析顯示，各染毒組大鼠子宮組織中LHR表達(dá)水平較對照組明顯降低（P＜0.05）；其他受體表達(dá)水平隨劑量增加呈下降趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 6.隨著MEHP染毒劑量增加，顆粒細(xì)胞的相對活力逐漸下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 7.隨著MEHP染毒劑量增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中的P4與E2激素分泌水平隨之增加，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 8.與對照組比較，MEHP染毒組卵巢顆粒細(xì)胞中免疫組織化學(xué)染色程度增強(qiáng)，面積增加。半定量分析顯示，各染毒組卵巢顆粒細(xì)胞FSHR表達(dá)水平與對照組比較明顯增加（P＜0.05）。 第二部分DEHP和MEHP對性激素合成通路基因及其受體表達(dá)的影響和機(jī)制 1.各染毒組大鼠卵巢性激素合成通路STAR、P450scc、3β-HSD、17β-HSD Ι、17β-HSD II和P450arom基因相對表達(dá)水平與對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨DEHP染毒劑量增加而明顯下降，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。 2.與對照組比較，DEHP染毒組大鼠卵巢和子宮組織中PR、ER免疫組織化學(xué)染色程度減弱，面積減小。半定量分析顯示，卵巢組織中PR、ER表達(dá)水平隨DEHP染毒劑量增加而明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而各染毒組子宮組織PR、ER表達(dá)水平與對照組比較無明顯差異（P＞0.05）。 3. MEHP體外染毒卵巢顆粒細(xì)胞，性激素合成通路STAR、P_(450)scc、17β-HSDΙ及17β-HSD II基因相對表達(dá)水平與對照組比較明顯增加（P＜0.05），而各組3β-HSD、P_(450)arom基因相對表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05）。 4. MEHP染毒組卵巢顆粒細(xì)胞PR、ER免疫組織化學(xué)染色程度增強(qiáng)，面積增加。半定量分析顯示，卵巢顆粒細(xì)胞PR、ER表達(dá)水平與對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且隨MEHP染毒劑量增加明顯增高。 第三部分DEHP和MEHP對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制 1. DEHP能夠使大鼠卵巢顆粒細(xì)胞早期、晚期及總凋亡率明顯增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2蛋白比例是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，隨著DEHP染毒劑量的增加，Bax/Bcl-2逐漸升高，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；而各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2. MEHP能夠使大鼠體外卵巢顆粒細(xì)胞早期、晚期及總凋亡率明顯增加（P＜0.05），隨著MEHP染毒劑量的增加，Bax/Bcl-2逐漸升高，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；各染毒組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞Caspase-3活性與對照組比較明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 1．DEHP暴露能夠引起雌性大鼠動(dòng)情后期、動(dòng)情間期持續(xù)時(shí)間明顯延長，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)情周期時(shí)間明顯延長；DEHP染毒能夠使雌性大鼠卵巢臟器系數(shù)降低，引起卵巢卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞不同程度損傷，提示卵巢可能是DEHP雌性生殖毒性作用的主要靶器官。 2.成功建立大鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，MEHP染毒能夠降低卵巢顆粒細(xì)胞相對活力，抑制顆粒細(xì)胞增殖。 3. DEHP暴露能夠降低大鼠卵巢性激素合成通路STAR、P_(450)scc、3β-HSD、17β-HSD Ι、17β-HSD II和P_(450)arom基因和性激素受體表達(dá)水平，抑制FSH、LH、P4、T和E2激素分泌，提示DEHP可能通過影響卵巢性激素合成通路相關(guān)基因和性激素受體表達(dá)，干擾卵巢生殖內(nèi)分泌功能。 4. MEHP體外染毒能夠增加卵巢顆粒細(xì)胞性激素合成通路STAR、P_(450)scc、17β-HSD Ι及17β-HSD II基因和性激素受體表達(dá)水平，刺激顆粒細(xì)胞P_4與E_2激素分泌，干擾體外顆粒細(xì)胞正常的分泌功能。 5.體內(nèi)DEHP暴露和體外MEHP染毒均能夠增加大鼠卵巢顆粒細(xì)胞早期、晚期及總凋亡率，增高Bax/Bcl-2比值，激活顆粒細(xì)胞內(nèi)Caspase-3，提示DEHP和MEHP可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。 總之，DEHP及其代謝產(chǎn)物MEHP能夠?qū)Υ菩源笫笊称鞴俸蜕硟?nèi)分泌功能產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，具有一定的雌性生殖毒性，對生物具有一定的生殖內(nèi)分泌干擾作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2567823