【摘要】：阪崎腸桿菌（Enterobactorsakazakii，ES）是一種嚴(yán)重危害嬰幼兒健康的食源性病原菌，在環(huán)境中廣泛存在。該菌感染嬰幼兒可引起新生兒嚴(yán)重的敗血癥、腦膜炎以及壞死性結(jié)腸炎，，因此快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法是預(yù)防和控制該菌感染的關(guān)鍵。本研究制備了ES脂多糖（LPS）及其單克隆抗體，對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了分析，并且建立了檢測(cè)ES菌體的雙抗體夾心ELISA方法，為該菌的防控、免疫學(xué)檢測(cè)以及致病機(jī)理的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 保存條件不同的ES菌體，分別采用熱酚水法和冷酚水法提取3種ESLPS抗原，同時(shí)收集水相和酚相的LPS，并對(duì)其純度、產(chǎn)率、免疫反應(yīng)性等特性進(jìn)行比較分析。3種LPS產(chǎn)率分別為6.21%、13.09%、7.57%；3種LPS多糖含量分別為7.26%、16.54%、5.91%，蛋白含量均小于0.5%，分子量均分布在14.4~45.0KD之間。用制備的抗原加強(qiáng)免疫小鼠，與對(duì)照組相比在短時(shí)間內(nèi)試驗(yàn)組小鼠的血清抗體效價(jià)可從1:8000提高至1:12000。 用熱滅活的ESATCC51329菌體抗原對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，融合前3天用LPS抗原及菌體抗原聯(lián)合加強(qiáng)免疫。采用50%聚乙二醇2000將小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。以ES菌體結(jié)合LPS作為篩選抗原建立間接ELISA篩選方法。采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行3~4次亞克隆，最終共獲得9株可穩(wěn)定分泌ES-LPS單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。其中1A11、2A7、4B10三株是針對(duì)ES-LPS核心多糖，其免疫球蛋白亞類分別為IgG1、IgG3和IgG3。采用體內(nèi)腹水誘生法制備單克隆抗體，并將收集的腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀和SephacryL-300進(jìn)行純化。用ELISA法檢測(cè)腹水和細(xì)胞上清效價(jià)，三株單抗的腹水效價(jià)可達(dá)1:104~105，1A11的細(xì)胞上清效價(jià)為1:2560，2A7和4B10為1:1280。分析3株單抗的抗原位點(diǎn)，結(jié)果表明3株單抗針對(duì)不同的抗原位點(diǎn)。SDS-PAGE表明3株單抗重鏈分子量約為50KD，輕鏈分子量約為25KD。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明3株細(xì)胞在克隆化過(guò)程中細(xì)胞上清OD450總體呈上升趨勢(shì)，傳代腹水效價(jià)均可達(dá)1:104，具有較好的穩(wěn)定性。特異性結(jié)果顯示：除單抗2A7、4B10純化的腹水抗體與大腸桿菌存在微弱交叉反應(yīng)外，其余15株受試菌株均與三株單抗不發(fā)生交叉反應(yīng) 取單克隆抗體1A11，經(jīng)改良過(guò)碘酸鈉法制備成辣根過(guò)氧化物酶（HRP）酶標(biāo)抗體，即1A11-HRP。以單克隆抗體2A7為捕獲抗體、1A11-HRP為檢測(cè)抗體建立ES雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。該方法對(duì)C.Muytjensii屬的ESATCC51329菌體具有特異性，但與受試的Cronobacter sakazakii(如:ATCC29544，ATCC12868)屬菌株沒(méi)有交叉反應(yīng)，該方法對(duì)純培養(yǎng)液的檢測(cè)限在103~105cfu/ml，即每孔100~10000cfu。本方法可用于對(duì)ESC.Muytjensii屬細(xì)菌的檢測(cè)，并有望與其他檢測(cè)方法結(jié)合用于對(duì)ES的檢測(cè)。
【圖文】：

圖 2 -1 不 連 續(xù) 光譜 掃 描 結(jié)果 Fi g . 2 -1 R e s u lt o f s p e c tr u m s c a n ni n g2. 2. 4 相對(duì) 分 子質(zhì) 量 S DS -P A G E 銀 染 結(jié) 果 顯 示 ， 3 種 LP S 的 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 差 異 不 大 ， 均 分 布 在14 .4 ~ 4 5 . 0K D 之 間 ，且 呈現(xiàn) 典 型 的 階梯 狀 電泳 條帶 。 3 種 不同 提 取物 的酚 相 和 水

純化LPS的SDS-PAGE分析
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R155.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2563759