【摘要】：β-1,3-1,4-葡聚糖酶(β-1,3-1,4-glucanase, E.C.3.2.1.73，簡(jiǎn)稱β-葡聚糖酶)屬于糖基水解酶類，降解β-葡聚糖中與β-1,3糖苷鍵相鄰的β-1,4糖苷鍵。β-葡聚糖酶是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于啤酒和飼料工業(yè)中。在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，大麥中的β-葡聚糖會(huì)降低麥芽汁和啤酒過(guò)濾速度，在啤酒貯存過(guò)程中容易引起沉淀等問(wèn)題；在畜禽飼料中如含有較多的β-葡聚糖會(huì)增加食糜粘度，影響動(dòng)物內(nèi)源性消化酶與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸，降低飼料的消化率。β-葡聚糖酶可有效避免β-葡聚糖在釀造和飼料工業(yè)中的上述不良影響，提高啤酒的質(zhì)量和飼料的消化率。 熱穩(wěn)定性差和催化活性低是當(dāng)前β-葡聚糖酶在工業(yè)應(yīng)用中普遍存在的問(wèn)題。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)β-葡聚糖酶在酸性條件具有較高的酶活性，但其熱穩(wěn)定性較差；熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)是一種嗜熱的厭氧菌，其所產(chǎn)生的β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性高于芽孢桿菌所產(chǎn)生的β-葡聚糖酶，但酶活力較低。本研究以熱纖梭菌β-葡聚糖酶和解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶基因?yàn)檠芯坎牧�，采用基因重疊延伸技術(shù)(SOE)，將二者β-葡聚糖酶基因進(jìn)行雜合和融合，構(gòu)建耐熱、高活性的β-葡聚糖酶。研究的主要結(jié)果如下： 1.構(gòu)建了解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶。經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，該酶的酶活性為80U mL~(-1)，純化后酶的比活力為1106U mg~(-1)，最適反應(yīng)溫度和pH分別為50℃和6.0，在pH5.0-7.0范圍內(nèi)，具有較高的酶活性；以大麥葡聚糖為底物時(shí)，該酶的米氏常數(shù)(K_m)和催化效率常數(shù)(K_(cat)/K_m)分別為1.5mg mL~(-1)和369mL mg~(-1)s~(-1)；在80℃溫度下處理30min，解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶僅有16%的殘余酶活，具有較低的耐熱性。 2.構(gòu)建了熱纖梭菌缺失錨定結(jié)構(gòu)域β-葡聚糖酶。經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，該酶的酶活性為7.8U mL~(-1)，純化后的比活力為275U mg~(-1)，最適反應(yīng)溫度和pH分別為70℃和8.0，在pH7.0-9.0范圍內(nèi)，具有較高的酶活性；該酶的K_m和K_(cat)/K_m分別為2.7mg mL~(-1)和51mL mg~(-1)s~(-1)，在80℃溫度下處理30min，有60%的殘余酶活；與解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶相比，熱纖梭菌缺失錨定結(jié)構(gòu)域β-葡聚糖酶的催化活性較低，但具有較高的熱穩(wěn)定性。 3.融合β-葡聚糖酶的構(gòu)建。將熱纖梭菌β-葡聚糖酶N-端13個(gè)和27個(gè)氨基酸殘基分別與解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶N端融合，構(gòu)建融合β-葡聚糖酶，分別命名為R13和R27。純化后R13和R27的比活力分別為1074U mg~(-1)和1013U mg~(-1)，它們的最適反應(yīng)溫度和pH分別為60℃和6.0；在80℃溫度下處理30min，R13和R27分別保留34%和52%的殘余酶活，分別高出解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶殘余酶活的18%和36%，但它們的耐熱性均低于熱纖梭菌β-葡聚糖酶。表明融合熱纖梭菌β-葡聚糖酶N-端13個(gè)和27個(gè)氨基酸殘基，能夠提高解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶的耐熱性。酶催化動(dòng)力學(xué)研究表明，R13的K_m和K_(cat)/K_m分別為1.7mg mL~(-1)和324mL mg~(-1)s~(-1)，R27的K_m和K_(cat)/K_m分別為1.9mg mL~(-1)和288mL mg~(-1)s~(-1)。與解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶的催化活性相比較，R13和R27均有不同程度的降低，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌N-端融合熱纖梭菌β-葡聚糖酶N-端13或27個(gè)氨基酸殘基后，降低了解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶與底物的親和力，進(jìn)而影響了酶的催化活性，其中融合熱纖梭菌β-葡聚糖酶N-端27個(gè)氨基酸殘基對(duì)解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶催化活性的抑制作用大于融合13個(gè)氨基酸殘基的抑制作用。 4.雙催化結(jié)構(gòu)域β-葡聚糖酶的構(gòu)建。將解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶的催化結(jié)構(gòu)域和熱纖梭菌β-葡聚糖酶的催化結(jié)構(gòu)域連接，構(gòu)建雙催化結(jié)構(gòu)域β-葡聚糖酶。構(gòu)建的雙催化結(jié)構(gòu)域β-葡聚糖酶命名為RQ，純化后RQ的比活力為2434U mg~(-1)，RQ的最適反應(yīng)溫度和pH分別為70℃和6.0；耐熱性研究表明，在80℃溫度下處理30min，RQ有67%的殘余酶活，分別高出R13和R27殘余酶活的33%和15%，RQ的耐熱性與熱纖梭菌β-葡聚糖的耐熱性相接近；RQ的K_m和K_(cat)/K_m分別為1.2mg mL~(-1)和1014mL mg~(-1)s~(-1)，其催化效率分別是R13和R27催化效率的3.13倍和3.52倍，也是解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶和熱纖梭菌β-葡聚糖酶催化效率之和的2.41倍。以上結(jié)果表明：RQ的酶學(xué)性質(zhì)并不是簡(jiǎn)單的解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶和熱纖梭菌β-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)的疊加，而是賦予了新的酶學(xué)特性的β-葡聚糖酶，它除具有熱纖梭菌β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性外，其催化效率也高于解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶和熱纖梭菌β-葡聚糖酶的催化效率之和。熱纖梭菌β-葡聚糖酶的連接子可有效改善雙催化結(jié)構(gòu)域β-葡聚糖酶的耐熱性和催化活性。 5.雙催化結(jié)構(gòu)域β-葡聚糖酶的耐熱機(jī)理初步研究。將RQ中熱纖梭菌β-葡聚糖酶的兩個(gè)催化活性位點(diǎn)的谷氨酸(E134和E138)定點(diǎn)突變?yōu)楸彼?E134A和E138A)，構(gòu)建含點(diǎn)突變的雙催化結(jié)構(gòu)域β-葡聚糖酶，并命名為RQM。耐熱性研究表明，在80℃溫度下處理30min，，RQM有57%的殘余酶活，分別比解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶、R13和R27的耐熱性提高了41%、23%和5%；與熱纖梭菌β-葡聚糖酶和RQ的耐熱性相比，RQM的耐熱性分別降低了3%和10%。說(shuō)明熱纖梭菌β-葡聚糖酶不僅其N-端對(duì)RQ的耐熱性有影響，而且其催化結(jié)構(gòu)域的整個(gè)結(jié)構(gòu)在穩(wěn)定酶分子中發(fā)揮作用，包括其催化活性位點(diǎn)，熱纖梭菌β-葡聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域和解淀粉芽孢桿菌β-葡聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域之間相互影響，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，形成一種特性優(yōu)良的、新的β-葡聚糖酶。 6.雙催化結(jié)構(gòu)域β-葡聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如下：大麥粉43.48g L~(-1)、豆粉34.40g L~(-1)、NaCl2.40g L~(-1)、KH_2PO_42.40g L~(-1)和K_2HPO_412.50g L~(-1)；接種量1%(V/V)、裝樣量45mL/250mL、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH6.0-7.0、最佳誘導(dǎo)時(shí)期為在200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)3h后誘導(dǎo)。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)β-葡聚糖酶的量為110U mL~(-1)，比初始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了11%。雖然發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的量沒(méi)有得到大幅度提高，但是優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源和氮源是廉價(jià)的大麥粉和豆粉，大大降低了β-葡聚糖酶的生產(chǎn)成本，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

簡(jiǎn)稱 β-葡聚糖酶)是水解 β-葡聚糖中與 β-1,3 糖苷鍵相鄰的 β-1,4 糖苷鍵的水解酶。β-葡聚糖酶水解 β-葡聚糖的主要產(chǎn)物是纖維三糖和纖維四糖 (如圖1-1)[2]。不僅植物能夠產(chǎn)生 β-葡聚糖酶，而且許多微生物 (細(xì)菌和真菌)也能夠分泌 β-葡聚糖酶，用來(lái)降解它們周圍環(huán)境中的多糖，為其生長(zhǎng)提供能源。植物 β-葡聚糖酶屬于糖基水解酶家族 17，它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)呈(a/β)8折疊桶狀，而微生物 β-葡聚糖酶屬于糖基水解酶家族 16，其酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)果凍狀 β-三明治結(jié)構(gòu)[3]。雖然植物 β-葡聚糖酶和微生物 β-葡聚糖酶具有相同的底物專一性，但二者無(wú)論是在氨基酸序列上還是在三級(jí)結(jié)構(gòu)上都不具有相似性。微生物 β-葡聚糖酶是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于啤酒和飼料工業(yè)中。在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，大麥中內(nèi)源性的 β-葡聚糖酶由于高溫而失活

圖 1-2 浸麻芽孢桿菌的 β-葡聚糖酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖1-2 The three dimensional structure of β-glucanases from Bacillus ma生化特性葡聚糖酶的分子量大約在 25-30 kDa 之間，它們的等電點(diǎn)為 7作用 pH 為 9.0，嗜堿芽孢桿菌在 pH 7.0-12 范圍內(nèi)仍保留大于 8酶的最適作用 pH 在 6.0-7.5 之間。不同芽孢桿菌的 β-葡聚糖酶的 (Bacillus polymyxa)[11]，55 ℃ (解淀粉芽孢桿菌 (B. amyloliquefa(浸麻芽孢桿菌 (Bacillus macerans)[12])，地衣芽孢桿菌 (Bacillus水解大麥 β-葡聚糖轉(zhuǎn)化為還原糖葡萄糖的量計(jì)算，芽孢桿菌的 βl min-1mg-1之間，以大麥葡聚糖為底物時(shí)，芽孢桿菌 β-葡聚糖酶聚糖酶相比，非芽孢桿菌 β-葡聚糖酶往往帶有其他不同功能的結(jié)桿菌 β-葡聚糖酶和芽孢桿菌 β-葡聚糖酶具有相似的生化特性。不子量和最適反應(yīng)溫度，如下表 1-1 所示。表 1-1 非芽胞桿菌的 β-葡聚糖酶的部分酶學(xué)性質(zhì)Table 1-1 Enzyme characteristics of the non-Bacillus β-glucanase種類 分子量（kDa） 最適 pH 最適溫度（℃纖梭菌m thermocellum)38 6.6-10 80 絲狀桿菌er succinogenes)37 6.0 50
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R151

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2528270