發(fā)布時間：2019-08-06 09:29

【摘要】：益生菌具有多種生理功能，被廣泛應用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域，新型菌種的出現(xiàn)也加快了益生菌產(chǎn)業(yè)化的進程，同時益生菌的安全性問題引起了廣大學者關(guān)注，大多數(shù)的益生菌在長期的使用過程中被認為是相對安全的，但是近年來許多菌屬從人的感染性損傷組織中分離出來，并且也出現(xiàn)服用益生菌制品所導致的病例，這使得益生菌的安全性成為一個不容忽視的問題，引起了人們對益生菌安全性的重新認識。 目的：保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌是乳制品中常用的三種益生菌，本文采用體外Caco-2細胞模型方法考察這三種常用乳制品益生菌對腸道屏障功能的影響，探討這三種菌是否存在潛在的安全性問題。 方法：保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌的活化培養(yǎng)，調(diào)整益生菌的濃度為102-108cfu/mL，分別與Caco-2細胞共培養(yǎng)，用MTT比色法考察這三種菌對Caco-2細胞的毒性作用，計算本實驗條件下三種益生菌的IC50，將同一濃度三種益生菌按照1:1:1比例混合并計算混合菌的IC50；益生菌以108cfu/mL的濃度與分化的Caco-2細胞共培養(yǎng)48h，，ELISA方法檢測細胞因子IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-γ的分泌；建立Caco-2單層細胞模型，益生菌以108cfu/mL的濃度與單層模型共培養(yǎng)24h，酶標儀檢測酚紅的透過率，透射電鏡觀察細胞模型的緊密連接結(jié)構(gòu)；益生菌以108cfu/mL的濃度與Caco-2細胞共培養(yǎng)24h，通過免疫熒光法標記Caco-2細胞的β-微管蛋白，在激光共聚焦顯微鏡下觀察；益生菌以108cfu/mL的濃度與Caco-2細胞共培養(yǎng)24h，western blot分析Caco-2細胞緊密連接蛋白Occludin的表達。 結(jié)果：保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和混合菌在較低濃度時（≤104cfu/mL）對Caco-2細胞的增殖無顯著影響，未表現(xiàn)出細胞毒性作用，當這三種益生菌的濃度≥105cfu/mL時，可顯著的抑制Caco-2細胞（結(jié)腸癌細胞）增殖，當濃度≥107cfu/mL時，三種益生菌對Caco-2細胞表現(xiàn)出了細胞毒性作用，并計算得出了三種益生菌在本實驗條件下的的半數(shù)抑制濃度（IC50），保加利亞桿菌IC50=1.19108cfu/mL、嗜酸乳桿菌IC50=3.93108cfu/mL、嗜熱鏈球菌IC50=2.02108cfu/mL，混合菌IC50=3.93108cfu/mL益生菌對體外培養(yǎng)的Caco-2細胞無聯(lián)合毒性作用；保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌（108cfu/mL）作用于Caco-2細胞48h后，細胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ及IL-10分泌無影響；保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌（108cfu/mL）作用于Caco-2細胞單層模型24h、48h、72h后，對Caco-2細胞單層模型酚紅透過率無影響，嗜熱鏈球菌（108cfu/mL）作用于72h后，顯著增加了Caco-2細胞單層酚紅透過率，三種益生菌作用24h后，在透射電鏡下觀察緊密連接結(jié)構(gòu)完好，未出現(xiàn)異常變化，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌單獨作用未對細胞單層的緊密連接結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞性的影響；保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌（108cfu/mL）與Caco-2細胞共培養(yǎng)24h，對細胞骨架蛋白β-tublin無影響；保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌（108cfu/mL）與Caco-2細胞共培養(yǎng)24h，Caco-2細胞的緊密連接蛋白Occludin表達無影響。結(jié)論：體外Caco-2細胞試驗表明，三種常用的乳制品益生菌并未對腸道屏障功能產(chǎn)生不良影響，不存在潛在的安全性問題。
【圖文】：

2.1.2.3.2 三種益生菌聯(lián)合作用將處于同一濃度級別的三種益生菌按照 1:1:1 的比例進行混合，各組菌濃度分別為 102、103、104、105、106、107、108cfu/mL，用 MTT 法檢測細胞活性，具體操作方法同上。2.1.2.4 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0 分析，方差分析采用 LSD 法（方差齊性）和 Dunnett’s法（方差非齊性），檢驗水準 α=0.05。2.2 結(jié) 果2.2.1 顯微鏡下觀察 Caco-2 細胞的形態(tài)Caco-2 細胞經(jīng)復蘇培養(yǎng)后，狀態(tài)良好，下圖（圖 2.1）為所培養(yǎng)細胞情況。每隔 1-3 天換液一次。當細胞達到 70 %-80 ％融合時，進行細胞傳代。消化后的細胞呈圓形，且分散均勻。

嗜熱鏈球菌（1000×） 嗜熱鏈球菌（1000×）圖 2.3 顯微鏡下觀察經(jīng)革蘭氏染色后的益生菌Fig.2.3 Morphologic observation of probiotics stained by Gram's method2.2.4 益生菌的生長曲線2.2.4.1 保加利亞乳桿菌生長曲線保加利亞乳桿菌生長狀況良好，隨著時間的增加，OD 值逐漸增大，細菌的數(shù)量增多，在 4-12 小時之間，細菌數(shù)迅速增大，20 小時后細菌的數(shù)量趨于穩(wěn)定。見圖 2.4
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R151

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 雷虹;王麗麗;孫夢媛;付斌;平文祥;;Lb.paracasei HD1.7對小鼠免疫能力的調(diào)節(jié)作用[J];黑龍江大學自然科學學報;2013年02期

本文編號：2523470