【摘要】：鎘(Cadmium,Cd)是一種廣泛存在的重金屬，在現(xiàn)代采礦、冶煉等工業(yè)活動(dòng)中，容易成為環(huán)境污染物。鎘由于其急性毒性作用和蓄積作用導(dǎo)致的慢性毒性作用，于1994年被國(guó)際癌癥研究會(huì)(IARC)定為ⅠA級(jí)致癌物，即人類致癌物，美國(guó)毒物藥理委員會(huì)(ATSDR)將其列為第6位危害人體健康的有毒物質(zhì)。 鎘的急性毒性作用表現(xiàn)為對(duì)生物體的氧化損傷，且由于蓄積作用強(qiáng)、在人體內(nèi)排出速度慢，生物半衰期達(dá)到10-30年，是已知的最容易在體內(nèi)蓄積的毒物，常引發(fā)氧化損傷而最終導(dǎo)致腫瘤、衰老和生殖系統(tǒng)的損害。鎘的DNA損傷作用與其直接損傷DNA和抑制DNA的修復(fù)有關(guān)。鎘的常見(jiàn)無(wú)機(jī)化合物氯化鎘(CdCl_2)的毒性作用表現(xiàn)為誘發(fā)活性氧的產(chǎn)生、引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程等。最新的研究表明，鎘可以誘發(fā)多種細(xì)胞凋亡，特定的細(xì)胞株更是表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。 α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，LA）化學(xué)名稱為1，2-二硫戊環(huán)-3-戊酸（1，2-dithiolane-3-pentanoic acid），化學(xué)分子式為C_8H_(14)O_2S_2，分子量為206.33。硫辛酸在1951年由REED首次從豬肝臟中提取出來(lái)，研究者們自此開(kāi)始了對(duì)硫辛酸的大量研究，逐步揭示出硫辛酸在清除ROS、螯合金屬離子、再生抗氧化物質(zhì)、修復(fù)氧化損傷等多方面抗氧化作用。Packer教授提出的“網(wǎng)絡(luò)抗氧化”新理論顯示，機(jī)體的抗氧化功能主要由Vc、Ve、CoQ_(10)、GSH和LA五種抗氧化劑完成，五種抗氧化劑并不是單一地發(fā)揮保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的作用，而是有機(jī)地構(gòu)成一個(gè)完整的協(xié)作化的抗氧化防御的系統(tǒng)。其中硫辛酸還具有再生其它抗氧化劑的功能，成為網(wǎng)絡(luò)抗氧化的核心。本研究從硫辛酸對(duì)氯化鎘致L02細(xì)胞存活率的影響開(kāi)始，以氯化鎘作為氧化損傷毒物，以L02細(xì)胞作為靶細(xì)胞，從硫辛酸對(duì)L02細(xì)胞ROS、MDA水平的影響和DNA損傷修復(fù)等多方面著手，以期初步闡述硫辛酸的抗氧化劑作用。 第一部分硫辛酸對(duì)氯化鎘致L02細(xì)胞存活率的影響 目的：探討硫辛酸拮抗氯化鎘所導(dǎo)致的L02細(xì)胞死亡的作用。 方法：實(shí)驗(yàn)采用MTT實(shí)驗(yàn)（比色試驗(yàn)）測(cè)定細(xì)胞存活率。對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的L02細(xì)胞進(jìn)行硫辛酸預(yù)處理6小時(shí)，并在氯化鎘染毒過(guò)程中也加入硫辛酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)保護(hù)，24小時(shí)后觀察各組L02細(xì)胞的存活率。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，25μmol/L的氯化鎘能夠明顯導(dǎo)致L02細(xì)胞死亡（存活率為55.81%，P＜0.05），10mg/ml的硫辛酸不會(huì)導(dǎo)致L02細(xì)胞死亡（存活率為103.61%，P＞0.05）；與鎘單獨(dú)作用組比較，低濃度硫辛酸不能拮抗氯化鎘導(dǎo)致的L02細(xì)胞死亡（存活率為56.31%，P＞0.05），中、高濃度的硫辛酸可以拮抗氯化鎘導(dǎo)致的L02細(xì)胞死亡（存活率為73.82%，109.25%，P＜0.05）；與對(duì)照組相比，高濃度的硫辛酸可以完全拮抗氯化鎘導(dǎo)致的L02細(xì)胞死亡（存活率為109.25%， P＞0.05）。 結(jié)論：硫辛酸可以拮抗氯化鎘所導(dǎo)致的L02細(xì)胞死亡，使細(xì)胞存活率上升。 第二部分硫辛酸對(duì)氯化鎘誘發(fā)L02細(xì)胞ROS水平的影響 目的：探討硫辛酸對(duì)氯化鎘誘發(fā)L02細(xì)胞ROS的清除作用。 方法：利用DCFH-DA作為熒光探針，以氯化鎘作為染毒物質(zhì)，硫辛酸作為保護(hù)劑，L02細(xì)胞作為靶細(xì)胞，測(cè)定各組DCF熒光強(qiáng)度值的大小以判定ROS的水平。對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的L02細(xì)胞進(jìn)行硫辛酸預(yù)處理6小時(shí)，并在氯化鎘染毒過(guò)程中也加入硫辛酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)保護(hù)，測(cè)定各組在染毒2小時(shí)內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度的大�。碦OS的表達(dá)水平）。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，25μmol/L的氯化鎘能夠明顯誘發(fā)L02細(xì)胞產(chǎn)生ROS（DCF熒光強(qiáng)度值為1652，P＜0.05），10mg/ml的硫辛酸不會(huì)誘發(fā)L02細(xì)胞產(chǎn)生ROS（DCF熒光強(qiáng)度值為1149，P＞0.05）；與鎘單獨(dú)作用組比較，低中高濃度硫辛酸都能降低氯化鎘誘發(fā)的ROS（DCF熒光強(qiáng)度值為1442，1162，822，P＜0.05）；與對(duì)照組相比，中濃度的硫辛酸可以降低氯化鎘誘發(fā)的ROS至正常細(xì)胞水平（P＞0.05），高濃度的硫辛酸可以降低氯化鎘誘發(fā)的ROS至正常細(xì)胞水平以下（P＜0.05）。 結(jié)論：硫辛酸能夠降低氯化鎘誘發(fā)的L02細(xì)胞產(chǎn)生的ROS。 第三部分硫辛酸對(duì)氯化鎘致L02細(xì)胞氧化損傷產(chǎn)物MDA水平的影響 目的：探討硫辛酸對(duì)氯化鎘致L02細(xì)胞氧化損傷的拮抗作用。 方法：以氯化鎘作為染毒物質(zhì)，硫辛酸作為保護(hù)劑，L02細(xì)胞作為靶細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的L02細(xì)胞進(jìn)行硫辛酸預(yù)處理6小時(shí)，并在氯化鎘染毒過(guò)程中也加入硫辛酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)保護(hù)，培養(yǎng)至24小時(shí)。先測(cè)定各組細(xì)胞總蛋白含量，再利用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定各組細(xì)胞經(jīng)總蛋白含量標(biāo)化的MDA含量。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，25μmol/L的氯化鎘能夠明顯導(dǎo)致L02細(xì)胞氧化損傷，使MDA含量上升（MDA含量為14.05nmol/mgprot，P＜0.05），10mg/ml的硫辛酸不會(huì)導(dǎo)致L02細(xì)胞MDA含量上升（5.63nmol/mgprot，P＞0.05）；與鎘單獨(dú)作用組相比，低中高濃度的硫辛酸都能夠降低氯化鎘所致的L02細(xì)胞的氧化損傷，使細(xì)胞中MDA含量降低（MDA含量依次為11.11、8.29、5.92nmol/mgprot，P＜0.05）；與對(duì)照組相比，10mg/ml的硫辛酸能夠完全保護(hù)L02細(xì)胞免受氯化鎘所致的氧化損傷，使細(xì)胞MDA含量達(dá)到正常水平（P＞0.05）。 結(jié)論：硫辛酸可以拮抗L02細(xì)胞免受氯化鎘所致的氧化損傷，使細(xì)胞MDA含量下降。 第四部分硫辛酸對(duì)氯化鎘致L02細(xì)胞DNA損傷的影響 目的：探討硫辛酸對(duì)氯化鎘致L02細(xì)胞DNA損傷的拮抗作用。 方法：以氯化鎘作為染毒物質(zhì)，硫辛酸作為保護(hù)劑，L02細(xì)胞作為靶細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的L02細(xì)胞進(jìn)行硫辛酸預(yù)處理6小時(shí)，并在氯化鎘染毒過(guò)程中也加入硫辛酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)保護(hù)，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（即彗星實(shí)驗(yàn)）測(cè)定細(xì)胞核在熒光下的Olive尾矩值，進(jìn)而分析各組細(xì)胞的DNA損傷程度。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，25μmol/L的氯化鎘能夠明顯導(dǎo)致L02細(xì)胞DNA損傷（Olive尾矩值為24.19，P＜0.05），10mg/ml的硫辛酸對(duì)L02細(xì)胞沒(méi)有DNA損傷作用（Olive尾矩值為1.27，P＞0.05）；與鎘單獨(dú)作用組相比，低中高濃度的硫辛酸都能保護(hù)L02細(xì)胞免受氯化鎘所導(dǎo)致的L02細(xì)胞DNA損傷（Olive尾矩值依次為18.09、10.62、5.17，P＜0.05）。 結(jié)論：硫辛酸可以保護(hù)L02細(xì)胞免受氯化鎘所致的DNA損傷
【圖文】：

圖 1 不同濃度氯化鎘染毒條件下 L02 細(xì)胞的存活率2 不同濃度 LA 對(duì)氯化鎘致 L02 細(xì)胞存活率降低的拮抗作用比對(duì)正常細(xì)胞，各組存活率依次為：氯化鎘單獨(dú)作用組（氯化鎘 25μm55.81%、硫辛酸最高劑量組（硫辛酸 10mg/ml）103.61%、低濃度硫辛酸和鎘聯(lián)合作用組（氯化鎘 25μmol/L+硫辛酸 0.1mg/ml）56.31%、中濃度硫辛酸化鎘聯(lián)合作用組（氯化鎘 25μmol/L+硫辛酸 1mg/ml）73.82%、高濃度硫辛氯化鎘聯(lián)合作用組（氯化鎘 25μmol/L+硫辛酸 10mg/ml）109.25%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)析，氯化鎘單獨(dú)作用組（氯化鎘 25μmol/L）L02 細(xì)胞存活率與正常細(xì)胞組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說(shuō)明氯化鎘在此濃度下能夠明顯導(dǎo)致細(xì)胞的死辛酸最高劑量組（硫辛酸 10mg/ml）L02 細(xì)胞存活率與正常細(xì)胞組相比，無(wú)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明硫辛酸作為保護(hù)劑，并沒(méi)有導(dǎo)致 L02 細(xì)胞存活率沒(méi)有毒性作用，那么在聯(lián)合組中 L02 細(xì)胞存活率的下降就可以認(rèn)為由氯化致；低濃度硫辛酸和氯化鎘聯(lián)合作用組（氯化鎘 25μmol/L+硫辛酸 0.1mg/m

圖 2 不同濃度 LA 與氯化鎘聯(lián)合作用下 L02 細(xì)胞的存活率：與對(duì)照組相比，aP＜0.05，與鎘單獨(dú)作用組相比，bP＜0.05。討 論細(xì)胞存活率的檢測(cè)有乳酸脫氫酶釋放改良法、流式細(xì)胞儀法、同位素釋放法TT 法等，MTT 法由于簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速、無(wú)放射性污染等原因被廣泛應(yīng)用胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性測(cè)定以及生物活性因子的活性檢測(cè)等。MTT 法又稱 MTT 比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMS溶解細(xì)胞中的甲瓚，，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在 490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，接反映活細(xì)胞數(shù)量。為了保證 MTT 測(cè)定結(jié)果的線性關(guān)系，一般要求吸光度 0-0.7 之間，吸光度值過(guò)高或過(guò)低時(shí)都對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果靈敏度有較大的影響，因
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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10 趙靜s

本文編號(hào)：2516823