【摘要】：目的：建立氡染毒的動(dòng)物和細(xì)胞模型,研究氡染毒對(duì)小鼠肺組織和人支氣管上皮細(xì)胞的損傷效應(yīng),從表觀遺傳學(xué)角度,闡明長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNA)通過(guò)調(diào)控ErbB信號(hào)通路參與氡致肺支氣管上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。方法：(1)小鼠染氡模型建立：BALB/c小鼠30只,分為對(duì)照組和2個(gè)染氡劑量組,置于多功能生態(tài)氡室慢性吸入染毒,累積染毒劑量分別為0,60和120工作水平月(Working level month, WLM)。HE染色觀察小鼠肺部病理改變。Western Blot和免疫組化方法檢測(cè)ErbB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。(2)細(xì)胞染氡模型建立：對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)進(jìn)行氡染毒,染氡的濃度為20000Bq/m3,染毒時(shí)間為20min/次,染毒3d后再重復(fù)1次,連續(xù)染毒2次后作為染毒第1代(Rn1),分別染氡5代(Rn5)和10代(Rn10)。CCK-8法測(cè)定生長(zhǎng)曲線、平板克隆和細(xì)胞錨著獨(dú)立生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和ROS變化、生化法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活力,Western Blot和免疫組化方法檢測(cè)ErbB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。(3)ErbB信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)：采用Western Blot和免疫組化方法,檢測(cè)氡染毒后ErbB信號(hào)通路相關(guān)蛋白,包括ErbB2、K-ras、C-abl和Mig6等的表達(dá)改變。(4)差異表達(dá)lncRNA篩選：采用生物芯片篩選小鼠染氡后出現(xiàn)的差異表達(dá)的lncRNA,然后進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并構(gòu)建有關(guān)靶基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)。選擇表達(dá)明顯改變的lncRNA,用熒光原位雜交(FISH)方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光定位,依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)確定其堿基序列并預(yù)測(cè)其可能作用的蛋白分子。(5)基因沉默和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：在V79細(xì)胞中轉(zhuǎn)染lncRNA的特異性沉默體(lncRNA Smart Silencer), Western Blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。分別構(gòu)建lncRNA及其靶基因兩側(cè)UTR端的含熒光素酶基因的質(zhì)粒載體,通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后熒光素酶的活性驗(yàn)證作用靶點(diǎn)。結(jié)果：(1)氡染毒BALB/c小鼠肺組織HE染色結(jié)果顯示,肺間質(zhì)充血水腫,肺泡間隔增厚,炎細(xì)胞浸潤(rùn)和部分肺組織出現(xiàn)纖維化；免疫組化結(jié)果顯示,ErbB2和K-ras的表達(dá)升高,而C-abl、Mig6和p73的表達(dá)下降。Western Blot結(jié)果顯示ErbB2磷酸化水平增高,C-ab1、Mig6和K-ras蛋白表達(dá)與免疫組化檢測(cè)結(jié)果一致。(2)人支氣管上皮細(xì)胞染氡后,細(xì)胞生長(zhǎng)加快,侵襲性增強(qiáng),細(xì)胞中ROS和CAT增加,SOD酶活力下調(diào),細(xì)胞周期S期比例增多,ErbB信號(hào)通路中ErbB2/磷酸化和K-ras表達(dá)上調(diào),而C-abl和Mig6表達(dá)下調(diào)。(3)生物芯片篩選的結(jié)果,染氡小鼠肺組織中發(fā)生差異表達(dá)的IncRNA有1256條,其中表達(dá)上調(diào)的825條,表達(dá)下調(diào)的431條。通過(guò)GO和KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的IncRNA大多參與ErbB信號(hào)通路調(diào)節(jié)。采用real-time PCR,對(duì)其中9個(gè)IncRNA進(jìn)行定量驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)ELK1、FR146301、FR052959、n417375和XR 168810.1的表達(dá)與芯片篩選的結(jié)果一致,其中只有FR052959表達(dá)上調(diào)。(4) LncRNA_FR052959,用FISH熒光定位發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有分布,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)確定其堿基序列并預(yù)測(cè)其可能作用的蛋白分子為ErbB信號(hào)通路中的C-abl。(5)特異性沉默體和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),IncRNA FR052959能顯著抑制C-abl基因5'-UTR端活性,進(jìn)而調(diào)控ErbB信號(hào)通路中C-abl的表達(dá)。氡染毒后該抑制作用降低。結(jié)論：1、建立了氡染毒小鼠及支氣管上皮細(xì)胞損傷的模型。長(zhǎng)期氡照射可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)加快、細(xì)胞周期改變、氧化應(yīng)激增加、細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)等一系列細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化特征。2、在上述過(guò)程中,ErbB信號(hào)通路的相關(guān)基因和蛋白表達(dá)發(fā)生了改變,其中原癌基因ErbB和K-ras的表達(dá)上調(diào),負(fù)調(diào)控基因Mig6和C-abl的表達(dá)下調(diào)。提示ErbB信號(hào)通路參與了氡致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程。3、篩選出了氡染毒后表達(dá)上調(diào)的非編碼RNA lncRNA-FR052959,通過(guò)特異性沉默體以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制C-abl基因5'-UTR端活性,進(jìn)而調(diào)控ErbB信號(hào)通路中C-abl的表達(dá)。氡染毒的細(xì)胞中該抑制作用降低,提示RNA lncRNA-FR052959通過(guò)ErbB信號(hào)通路參與了氡致細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為闡明氡致肺癌的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供了新的研究方向。
文內(nèi)圖片：
圖片說(shuō)明： 引言邐巧致肺支氣管上巧細(xì)胞損傷中ＬｎｃＲＮＡ－ＥｒｂＢ調(diào)節(jié)巧路的改變逡逑ＲＮＡ核酸序列的長(zhǎng)度將其分為兩類：核酸序列長(zhǎng)度小于２００個(gè)核巧酸的非編碼逡逑ＲＮＡ稱為短／小非編碼民ＮＡ，，包括ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ腳ｉＲＮＡｓ）等；核酸序列長(zhǎng)度大逡逑于２００個(gè)核昔酸的非編碼ＲＮＡ稱為長(zhǎng)鏈非編碼１？＾＾入（１１１0１＾人）［２５］。有研究表明逡逑表明多數(shù)的ＩｎｃＲＮＡ缺乏編碼蛋白的能力，且ＩｎｃＲＮＡ的表達(dá)量也很低［２６］。逡逑Ａ逡逑
文內(nèi)圖片：
圖片說(shuō)明： Ｅk W翻逡逑悘W逡逑圖１．２對(duì)照組和染l#組小鼠肺組織中ＥｒｂＢ２／Ｋ－ｒａｓ蛋白改變逡逑Ｆｉｇｌ．２邋ＥｒｂＢ２／Ｋ－ｒａｓ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｌｕｎｇ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ邋ｒａｄｏｎ逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 iJ壽元;治歐肝伩v 引起肝肺支氣管v;一例報(bào)告[J];江蘇中醫(yī);1961年03期

2 張世范,王自生,陳文慶,賈書(shū)斌;肺支氣管良性腫瘤42例報(bào)告[J];西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志;1985年03期

3 王勇;;原發(fā)于左肺支氣管非何杰金氏淋巴瘤一例報(bào)告[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2003年02期

4 肖鳳芝,慈家俊;肺支氣管類癌臨床病理3例[J];黑龍江醫(yī)藥科學(xué);2004年01期

5 楊國(guó)儀,華惠琦,虞敏紅;肺支氣管粘膜上皮細(xì)胞在癌變中核DNA含量變化特點(diǎn)[J];實(shí)用腫瘤學(xué)雜志;2000年04期

6 ;激光用于肺支氣管腫瘤的治療[J];中國(guó)醫(yī)療器械信息;1998年01期

7 游玉峰,甘萬(wàn)崇,尹文化,柯偉;功能性肺葉切除動(dòng)物模型的建立[J];中國(guó)介入影像與治療學(xué);2005年01期

8 解好群,李曉云,成仲,馮清儀,閻宛舂;纖維支氣管鏡檢查對(duì)兒童肺支氣管疾病的診斷價(jià)值[J];中國(guó)內(nèi)鏡雜志;2005年01期

9 李國(guó)良;右肺支氣管炎性假瘤自行脫落1例[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;1998年11期

10 馬捷,張?zhí)┖?肺支氣管的嗜酸細(xì)胞性類癌的電鏡診斷[J];電子顯微學(xué)報(bào);2000年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 陳鎖成;丁國(guó)文;任正兵;王康榮;劉建;孫斌;戎國(guó)祥;董長(zhǎng)青;唐巍峰;;外科治療局部晚期肺癌[A];第八屆華東六省一市胸心血管外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 ;肺支氣管粼癌癥晚期應(yīng)做全身化療[N];中國(guó)消費(fèi)者報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 陳志海;氡致肺支氣管上皮細(xì)胞損傷中LncRNA-ErbB調(diào)節(jié)通路的改變[D];蘇州大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 黃秀義;肺支氣管樹(shù)三維形態(tài)模擬及其內(nèi)部氣體流動(dòng)的研究[D];四川大學(xué);2004年

2 賴偉;肺支氣管內(nèi)氣體分布與流動(dòng)的研究[D];四川大學(xué);2003年

本文編號(hào)：2515028