【摘要】：本論文對檢測動物源性食品中四環(huán)素殘留的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法進行了系統(tǒng)的研究。采用甲醛法將四環(huán)素與鑰孔血藍蛋白偶聯(lián)制備人工免疫原。通過免疫新西蘭大白兔得到抗血清,使用Protein A Sepharose-4B親和層析法純化血清得到高效價和高特異性的抗四環(huán)素多克隆抗體。采用甲醛法將四環(huán)素與卵血清白蛋白連接制備包被原,建立了間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法,對影響實驗的各因素(包被量,抗體稀釋度,抗體稀釋液等)進行了優(yōu)化與研究,最終確定包被量為0.05¨μgg/孔,抗體稀釋度為1：10000,抗體稀釋液為0.1%BSA/PBS,封閉液為0.5%乳粉/PBS溶液時所獲得的標準曲線靈敏度最高,穩(wěn)定性最好。本實驗所建立方法的靈敏度(IC50)為0.33±0.09μg/L,最低檢出限(IC15)為0.01±0.0041μg/L。本實驗所制備的抗體具有良好的特異性,與兩種結(jié)構(gòu)類似物土霉素、金霉素交叉反應率分別為0.39%和4.42%,與其他常用獸藥青霉素、鏈霉素、氯霉素均無交叉反應。選擇牛奶、蜂蜜、豬肉、牛肉、雞肉、魷魚、大眼鯛魚、比目魚、蝦作為樣品進行添加回收實驗,牛奶添加回收率為85.88%-109.17%,蜂蜜添加回收率為94.52%-107.59%,豬肉添加回收率為84.19%-98.96%,牛肉添加回收率為75.91%-105.58%,雞肉添加回收率為84.40%-109.64%,魷魚添加回收率為73.08%-115.44%,大眼鯛魚添加回收率為67.45%-104.76%,比目魚添加回收率為74.55%-112.46%,蝦添加回收率為82.84%-111.85%。本實驗所建立的方法在牛奶、魷魚中檢出限為5μg/kg,蜂蜜、豬肉、牛肉、雞肉、大眼鯛魚、比目魚、蝦檢出限為10μg/kg,板內(nèi)變異和板間變異均小于20%。使用國外試劑盒驗證本實驗建立的四環(huán)素間接競爭酶聯(lián)免疫法,兩種方法的檢測結(jié)果一致性很高,其線性回歸方程為：y=0.8542x+2.2848,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9954。說明本研究建立的方法具有很好的準確性和精密度。本研究所建立的四環(huán)素間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法靈敏度高、特異性好、準確性高、樣品前處理簡單,適合于動物源性食品中四環(huán)素殘留的快速檢測。
[Abstract]:In this paper, indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) for the detection of tetracycline residues in animal-derived foods was systematically studied. Artificial immunogen was prepared by coupling tetracycline with keyhole hemocyanin by formaldehyde method. Anti-tetracycline polyclonal antibodies were obtained by immunizing New Zealand white rabbits and purified by Protein-A-Sepharose-4B affinity chromatography. An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) was established by linking tetracycline with ovalbumin by formaldehyde method. The factors influencing the experiment, such as coating quantity, antibody dilution, antibody diluent, etc., were optimized and studied. The best stability and sensitivity of the standard curve were obtained when the coating volume was 0.05 渭 gg/, the dilution of antibody was 1 脳 10 000, the diluent of antibody was 0.1% BSA / PBS, and the blocking solution was 0.5% milk powder / PBS. the results showed that the best stability and sensitivity of the standard curve were obtained when the coating volume was 0.05 渭 mol / min, the dilution of antibody was 1? The sensitivity (IC50) and the minimum detection limit (IC15) of the method were 0.33 鹵0.09 渭 g / L and 0.01 鹵0.0041 渭 g / L, respectively. The cross-reaction rates with oxytetracycline and chloramphenicol were 0.39% and 4.42%, respectively. There was no cross-reaction with other commonly used veterinary drugs such as penicillin, streptomycin and chloramphenicol. Choose milk, honey, pork, beef, chicken, squid, big-eyed snapper, halibut, shrimp as samples to add and recycle experiment, milk added recovery rate is 85.88% and 109.17%. The recoveries of honey, pork, beef and chicken were 94.52% and 107.59%, 84.19%, 98.96%, 75.91% and 105.58%, 84.40% and 109.64%, respectively. The recovery of squid and bream was 73.08% / 115.44%, 67.45% / 104.76%, 74.55% / 112.46% and 82.84% / 111.85%, respectively. The detection limit of this method in milk and squid was 5 渭 g / kg, honey, pork, beef, chicken, snapper, halibut and shrimp. The detection limit was 10 渭 g / kg, intraplate variation and interplate variation less than 20%. The test results of tetracycline indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) were verified with foreign kits. The results of the two methods were consistent with each other. The linear regression equation was y = 0.8542 x 2.2848, and the linear correlation coefficient (R _ (2) was R _ (2) = 0.9954. It shows that the method established in this study has good accuracy and precision. The indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for tetracycline detection developed in this study has high sensitivity, specificity, high accuracy and simple pretreatment. It is suitable for the rapid detection of tetracycline residues in animal-derived foods.
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R155.5

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本文編號：2452277