【摘要】：砷化物是人類確定致癌物,亞砷酸鈉(NaAsO2)是砷元素在環(huán)境中存在的主要形式。由于砷化物致癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型一直未能成功建立,導(dǎo)致其致癌機(jī)制研究長期滯后。近年來砷化物所致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和DNA損傷及細(xì)胞凋亡的體外模型已被應(yīng)用于其致癌機(jī)制研究。目前發(fā)現(xiàn)不同水平砷化物致癌的分子機(jī)制可能不同,即低水平砷化物主要引起細(xì)胞過度增殖,從而引起細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而誘發(fā)癌癥；而高水平砷化物可通過產(chǎn)生大量活性氧(ROS)引起DNA損傷和細(xì)胞凋亡,從而引起細(xì)胞突變和基因組不穩(wěn)定性而誘發(fā)癌癥,但其具體的分子機(jī)制目前尚不清楚。 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)和腫瘤干細(xì)胞(Tumor stem cells, TSCs)樣特性獲得參與了多種疾病,特別與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。近年,雖然EMT和TSCs特性獲得與腫瘤細(xì)胞惡性程度和轉(zhuǎn)移關(guān)系及其分子機(jī)制的研究已成為熱點(diǎn),但對(duì)于EMT和TSCs特性獲得在環(huán)境致癌物所致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及致癌過程中的作用和分子機(jī)制的研究報(bào)道甚少。因此深入研究不同水平砷化物所致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和DNA損傷及細(xì)胞凋亡的具體信號(hào)通路,特別是研究調(diào)控砷化物誘導(dǎo)EMT過程中TSCs特性獲得在惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用及其分子機(jī)制對(duì)于尋找砷化物致癌的早期生物學(xué)標(biāo)志及發(fā)現(xiàn)新的防治措施具有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值。 方法 一、建立亞砷酸鈉所致人皮膚角質(zhì)(HaCaT)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化及DNA損傷和細(xì)胞凋亡模型 常規(guī)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞24h后,再分別用含0.0和1.0μM NaAsO2的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞48～72h,如此重復(fù)培養(yǎng)30代(約15周)后,觀察細(xì)胞增殖情況和惡性程度；用0.0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24或48h,觀察細(xì)胞增殖、DNA損傷和細(xì)胞凋亡情況。 二、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) 將惡性轉(zhuǎn)化和相關(guān)對(duì)照的HaCaT細(xì)胞與含0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖的RPMI1640培養(yǎng)液等體積混合后,鋪于含0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖的底層培養(yǎng)基上,待其凝固后,表面覆以適量培養(yǎng)液,37;C5%CO2培養(yǎng),每3-4天換液一次,4周后終止培養(yǎng)并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)。 三、裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn) 將惡性轉(zhuǎn)化和相關(guān)對(duì)照的HaCaT細(xì)胞按1×107/0.2mL密度注射于Balb/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下,飼養(yǎng)4周后將腫瘤組織取出,測量腫瘤體積、固定,并作組織切片、HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)鑒定。 四、逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR) 提取細(xì)胞總RNA并測定其濃度,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,分別應(yīng)用mot-2、mdm2、 survivin、CD34和K5引物擴(kuò)增后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 五、Western blot 提取細(xì)胞總蛋白并測定濃度,用SDS-PAGE分離蛋白、半干法轉(zhuǎn)膜,用特異性一抗4℃孵育過夜,進(jìn)一步常溫結(jié)合二抗1h后,用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化水平。 六、Southwestern blot 提取細(xì)胞總蛋白,SDS-PAGE分離、半干法轉(zhuǎn)膜后,將膜變性、復(fù)性處理,用生物素標(biāo)記的κB序列DNA探針與膜雜交,通過化學(xué)發(fā)光法檢測κB序列DNA與NF-κB的結(jié)合情況。 七、免疫共沉淀 提取細(xì)胞總蛋白,用IP抗體與蛋白混合過夜將靶蛋白沉淀后,用Western blot法檢測蛋白-蛋白相互作用或用Southwestern blot檢測DNA-蛋白相互作用。 八、免疫熒光法檢測p53的核轉(zhuǎn)位水平 將不同因素處理的HaCaT細(xì)胞用兔抗人p53一抗孵育24h后,用Cy3標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育1h,用DAPI將細(xì)胞核染色15mmin后熒光顯微鏡下觀察p53的胞內(nèi)分布以檢測p53的核轉(zhuǎn)位水平。 九、懸浮集落形成實(shí)驗(yàn) 將1×104細(xì)胞接種至低吸附24孔板中,用含10ng/ml EGF和10ng/ml FGFβ的無血清DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng),每2天進(jìn)行一次半定量換液,如此連續(xù)培養(yǎng)2周后,鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。 結(jié)果 一、亞砷酸鈉對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化及DNA損傷和凋亡的影響 用0.0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24h;分別用0.0和1.0μM NaAsO2慢性處理HaCaT細(xì)胞30代(約15周)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5、1.0和2.0μN(yùn)aAsO2引起HaCaT細(xì)胞增殖升高,1.0μM NaAsO2引起增殖最明顯,并出現(xiàn)γ-H2AX水平輕度升高；而5.0和10.0μM NaAsO2引起HaCaT細(xì)胞增殖降低、且γ-H2AX水平和斷裂caspase3水平均升高；1.0μM NaAsO2慢性處理HaCaT細(xì)胞能在裸鼠皮下形成腫瘤,腫瘤組織病理學(xué)切片顯示為低分化上皮樣癌細(xì)胞。結(jié)果顯示NaAsO2在低濃度引起HaCaT細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化：而在高濃度則引起HaCaT細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡。 二、亞砷酸鈉對(duì)HaCaT細(xì)胞p53/survivin和MAPKs及NF-κB信號(hào)通路的影響 用0.0、1.0、5.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0μMNaAsO2引起HaCaT細(xì)胞p-p53水平降低,而p-ERK、p-NF-κB/RelA、survivin和mot-2水平升高；5.0和10.0μM NaAsO2引起HaCaT細(xì)胞p-JNK、p-p38和p-p53水平升高,而survivin水平降低。結(jié)果顯示NaAsO2在低濃度主要激活ERK和NF-κB信號(hào)通路、抑制p53功能而引起survivin和mot-2水平升高,而高濃度則主要激活JNK和p38信號(hào)通路、激活p53功能和引起survivin水平降低。 三、MAPKs和NF-κB信號(hào)通路在亞砷酸鈉對(duì)p53的影響中的作用 分別用0.0和10.0μM ERK抑制劑U0126、NF-κB抑制劑Bay11-7082、JNK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580處理HaCaT細(xì)胞6h后,再分別用0.0、1.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻滯ERK和NF-κB均使1.0μM NaAsO2所致HaCaT細(xì)胞p-p53降低回升,且阻滯ERK使1.0μMNaAsO2所致HaCaT細(xì)胞核內(nèi)p53熒光強(qiáng)度降低回升；阻滯JNK則使10.0μMNaAsO2所致HaCaT細(xì)胞p-p53水平和核內(nèi)p53熒光強(qiáng)度升高回降。結(jié)果顯示ERK和NF-κB信號(hào)通路主要參與低濃度NaAsO2所致細(xì)胞p53抑制過程,JNK信號(hào)通路則主要參與高濃度NaAsO2所致細(xì)胞p53激活過程。 四、ERK通過NF-κB調(diào)控mot-2和survivin在低濃度亞砷酸鈉所致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用 用20.0nM NF-KB/RelA-siRNA和con-siRNA處理HaCaT細(xì)胞12h,或用0.0和10.0μM ERK抑制劑U0126處理HaCaT細(xì)胞6h后,再用0.0和1.0μMNaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻滯ERK信號(hào)通路可以阻止低濃度NaAsO2所致NF-κB與κB序列DNA結(jié)合能力；關(guān)閉NF-kB或抑制ERK均可使1.0μM NaAsO2所致HaCaT細(xì)胞mot-2和survivin的：mRNA和蛋白水平升高回降。結(jié)果顯示低濃度NaAsO2所致HaCaT細(xì)胞mot-2和survivin表達(dá)上調(diào)是通過ERK/NF-κB信號(hào)通路完成的。 分別用0.0和10.0μM ERK抑制劑U0126處理HaCaT細(xì)胞6h后,再用0.0和1.0μM NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24～48h,如此反復(fù)處理30代,結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻滯ERK信號(hào)通路可阻止1.0μM NaAsO2慢性處理30代所致HaCaT細(xì)胞增殖升高、軟瓊脂上形成克隆形成和裸鼠皮下形成腫瘤。結(jié)果顯示ERK在低濃度NaAsO2所致HaCaT細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化和致瘤性中具有重要作用。 五、JNK通過p53調(diào)控survivin在高濃度亞砷酸鈉所致HaCaT細(xì)胞DNA損傷和凋亡中的作用 分別用0.0和10.0μM JNK抑制劑SP600125處理HaCaT細(xì)胞6h后,再用0.0和10.0μM NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24h；發(fā)現(xiàn)阻滯JNK可抑制高濃度NaAsO2所致HaCaT細(xì)胞survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；發(fā)現(xiàn)高濃度NaAsO2使HaCaT細(xì)胞p53與JNK結(jié)合,而阻滯JNK后,p53主要與mdm2結(jié)合;10.0μM NaAsO2引起HaCaT細(xì)胞γ-H2AX水平和斷裂caspase3水平均升高;而用10.0μM NaAsO2聯(lián)合10.0μM SP600125處理HaCaT細(xì)胞γ-H2AX水平升高更多,而斷裂caspase3水平升高回降。結(jié)果顯示JNK通過激活p53而抑制survivin在高濃度NaAsO2所致HaCaT細(xì)胞DNA損傷和凋亡中具有重要作用。 六、低濃度亞砷酸鈉慢性處理誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生EMT和TSCs特性獲得 分別用0.0和1.0μM NaAsO2慢性處理HaCaT細(xì)胞30代后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0μMNaAsO2處理細(xì)胞20代時(shí)引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生間質(zhì)樣改變：細(xì)胞粘附能力下降,上皮細(xì)胞指標(biāo)E-cadherin水平降低,而間質(zhì)細(xì)胞指標(biāo)N-cadherin和vimentin水平以及干細(xì)胞表面抗原CD34和K5mRNA表達(dá)升高,細(xì)胞能夠形成懸浮細(xì)胞集落,且隨NaAsO2處理時(shí)間延長,上述改變越明顯。結(jié)果顯示低濃度NaAsO2慢性處理誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生EMT和獲得TSCs特性。 七、低濃度亞砷酸鈉慢性處理對(duì)HaCaT細(xì)胞NF-κB和snail的影響 分別用0.0和1.0μM NaAsO2慢性處理HaCaT細(xì)胞30代后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0μMNaAsO2處理細(xì)胞10代時(shí),引起HaCaT細(xì)胞經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路的p-IKKβ、 p-IκBβ和p-NF-κB/RelA水平均升高,snail水平也升高,且隨NaAsO2處理時(shí)間延長,上述改變越明顯。結(jié)果顯示低濃度NaAsO2慢性處理HaCaT細(xì)胞可激活經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路,且上調(diào)snail水平。 八、NF-κB在低濃度亞砷酸鈉所致HaCaT細(xì)胞snail升高中的作用 用0.0和1.0μM NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24或48h；用0.0和10.0μM NF-κB抑制劑Bay11-7082預(yù)處理HaCaT細(xì)胞6h或分別用20.0nM IKKβ-siRNA、 IKKa-siRNA或NF-κB/RelA-siRNA轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞12h后,再用0.0和1.0μMNaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0μM NaAsO2急性處理引起HaCaT細(xì)胞snail水平升高,并具有一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；阻滯經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路可抑制1.0μM NaAsO2急性處理所致HaCaT細(xì)胞snail水平升高。結(jié)果顯示低濃度NaAsO2急性處理可通過經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路而引起snail水平升高。 九、NF-κB在低濃度亞砷酸鈉所致HaCaT細(xì)胞EMT和TSCs特性獲得及致瘤性中的作用 分別用0.0和10.0μM NF-κB抑制劑Bayl1-7082預(yù)處理HaCaT細(xì)胞6h后,再分別用0.0和1.0μM NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞24～48h,如此重復(fù)處理30代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻滯NF-κB可抑制1.0μM NaAsO2慢性處理所致HaCaT細(xì)胞E-cadherin水平和細(xì)胞粘附能力下降及N-cadherin、vimentin、CD34和K5水平升高,抑制細(xì)胞形態(tài)發(fā)生間質(zhì)樣改變,抑制細(xì)胞懸浮集落形成能力和致瘤性。結(jié)果顯示NF-κB在低濃度NaAsO2慢性處理所致HaCaT細(xì)胞EMT和TSCs特性獲得及致瘤性過程中具有重要作用。 結(jié)論 1. NaAsO2在低濃度引起HaCaT細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化；而在高濃度則引起HaCaT細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡。 2.ERK激活NF-κB而抑制p53功能和引起survivin水平降低在低濃度NaAsO2所致HaCaT細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化過程中具有重要作用。 3.JNK激活p53功能而引起survivin水平升高在高濃度NaAsO2所致HaCaT細(xì)胞DNA損傷和凋亡中具有重要作用。 4.低濃度NaAsO2慢性處理所致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生EMT和TSCs特性獲得。 5.經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路激活而引起snail水平升高在低濃度NaAsO2慢性處理所致HaCaT細(xì)胞EMT和TSCs特性獲得及惡性轉(zhuǎn)化過程中具有重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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1 董雪;李曉翠;史艷芬;范洪學(xué);李榮貴;;亞砷酸鈉對(duì)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程的影響[J];中國老年學(xué)雜志;2011年01期

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本文編號(hào)：2452272