【摘要】：目的：乙烯菌核利(Vinclozolin, Vnz),是環(huán)境內(nèi)分泌抗雄激素干擾物之一,在環(huán)境中廣泛存在,常通過(guò)職業(yè)接觸、食物表面殘留和受污染的水體被人體攝入。Vnz常用作葡萄、果樹、蔬菜等真菌病的防治。新疆維吾爾自治區(qū)是我國(guó)葡萄生產(chǎn)第一大省(區(qū)),Vnz在葡萄種植中高頻使用,葡萄表面和葡萄酒中Vnz殘留已是普遍現(xiàn)象,這對(duì)食品安全形成潛在風(fēng)險(xiǎn)。與傳統(tǒng)抗雄激素藥物氟他胺不同,在胚胎性別分化關(guān)健期暴露Vnz可引起F1-F3雄性子代出現(xiàn)雄性生殖系表觀遺傳跨代繼承表型。因此,Vnz對(duì)人類、家畜、野生動(dòng)物的生命和繁殖帶來(lái)的廣泛性、長(zhǎng)期性潛在危害值得關(guān)注。目前,對(duì)源于胚胎期暴露Vnz引起的F1-F3子代表觀遺傳跨代繼承表型分子機(jī)制尚不清楚。Vnz的表觀遺傳甲基化機(jī)制研究還不能完全解釋跨代遺傳繼承表型現(xiàn)象。現(xiàn)提出多種假設(shè)學(xué)說(shuō),Nedd4介導(dǎo)的IGF-1R抗凋亡可能機(jī)制是其中的假設(shè)學(xué)說(shuō)之一。Nedd4屬泛素連接酶E3家族,Nedd4參與多種細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)通路的調(diào)控。IGF-1R、雄激素受體AR、PTEN等是Nedd4的泛素化作用底物。Nedd4通過(guò)IGF-1R調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞凋亡。Nedd4對(duì)AR的泛素化調(diào)節(jié)影響前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。Nedd4是Vnz調(diào)控睪丸分化的侯選基因之一。Vnz通過(guò)干擾雄激素與AR的結(jié)合發(fā)揮作用。基于以上理論基礎(chǔ),有學(xué)者提出Nedd4介導(dǎo)的IGF-1R抗凋亡機(jī)制可能是源于胚胎期暴露Vnz引起子代表觀遺傳跨代繼承表型的分子機(jī)制,目前這一機(jī)制未見(jiàn)實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。本文就Nedd4介導(dǎo)的Vnz生殖損傷跨代遺傳機(jī)制和Vnz對(duì)生殖細(xì)胞損傷的體外實(shí)驗(yàn)為主要研究?jī)?nèi)容,以生殖損傷和生殖細(xì)胞凋亡為主要觀察指標(biāo),通過(guò)現(xiàn)代多種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段,深入探討源于胚胎期暴露Vnz致子代生殖損傷的表觀遺傳跨代繼承表型機(jī)制,以期全面了解Vnz的生殖毒性,并為Vnz的合理使用和科學(xué)防護(hù)提供理論參考。方法：本研究由動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)體外實(shí)驗(yàn)兩大部分組成：一、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,選用SD孕大鼠,在E8-E14腹腔注射Vnz(100mg/kg/day),同時(shí)設(shè)立相應(yīng)對(duì)照,F1子代分別在P20(出生后20天)、P60(出生后60天)采樣,母鼠哺乳期結(jié)束后采樣。1.一般指標(biāo)測(cè)量：造模期間孕鼠體重增長(zhǎng)情況；F1P20、P60子代肝、腎、睪丸、卵巢組織重量及臟器比；2.P60雄性子代精子數(shù)量及形態(tài)的變化；3.化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)P60雄性子代血清睪酮(T)含量和P60雌性子代血清雌二醇(E2),孕酮(P)含量；酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)P60子代血清卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)含量；4.形態(tài)學(xué)檢測(cè)：常規(guī)HE染色病理切片進(jìn)行P20、P60子代肝、腎、睪丸、卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察；原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)P20、P60睪丸和卵巢組織凋亡；5.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)P20、P60子代睪丸和卵巢組織中Bcl-2、caspases3.caspases9蛋白的表達(dá)水平；6.Real-Time-PCR技術(shù)測(cè)定P20、P60子代睪丸和卵巢組織中Nedd4.Grb10、 IGF-1R;Bcl-2、caspases3.caspases9基因的表達(dá)水平。二、細(xì)胞培養(yǎng)體外實(shí)驗(yàn)1.建立大鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,研究Vnz對(duì)大鼠顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、分化和類固醇激素分泌的影響；并通過(guò)Vnz培養(yǎng)顆粒細(xì)胞IGF-1R濃度的變化和雌二醇分泌影響機(jī)理的研究,探討Vnz影響顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌的可能機(jī)制。2.建立大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,研究Vnz對(duì)大鼠間質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和睪酮分泌的影響；并通過(guò)Vnz培養(yǎng)間質(zhì)細(xì)胞cAMP和IGF-1R濃度的變化探討Vnz影響間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的可能機(jī)制。結(jié)果：一、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.Vnz暴露組孕鼠用藥期間體重增長(zhǎng)與對(duì)照比較無(wú)顯著性差異(P0.05)；Vnz暴露組母鼠平均產(chǎn)子數(shù)、出生子鼠雌雄比例、出生體重及出生存活率與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P0.05);Vnz暴露組P20、P60雄性子鼠體重、肝、腎臟重量及睪丸重量與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P0.05);Vnz暴露組P20雌雄子鼠肝重、腎臟重量無(wú)顯著性差異(P0.05)；P60子鼠雄性肝重、腎臟重量高于雌性(P0.05)；2.Vnz暴露組P60雄性子鼠精子數(shù)量減少(P0.05)；3.Vnz暴露組P60雌性子鼠血清雌二醇含量明顯低于對(duì)照組(P0.05),孕酮含量低于對(duì)照組,但無(wú)顯著性差異(P0.05); Vnz暴露組P60雄性子鼠血清睪酮含量明顯降低(P0.05)；4.Vnz可致P20、P60子代肝臟組織脂肪變性,肝索排列不整齊；Vnz致睪丸組織生精小管管腔變大,生精細(xì)胞減少并伴水腫；Vnz致P20子代卵巢顆粒細(xì)胞層分布不勻,致P60子代卵母細(xì)胞邊界不清,基膜增厚,卵母細(xì)胞透明帶皺縮、放射冠邊界不清,卵泡塌陷,出現(xiàn)卵泡閉鎖；5.Vnz暴露組P20、P60子代睪丸和卵巢均發(fā)生明顯凋亡(P0.05)；6.免疫組化結(jié)果：csapases3、caspases9在Vnz暴露組P20、P60子代睪丸和卵巢組織中表達(dá)增多(P0.05)；7. RT-PCR結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組P20、P60雄性子代及P60雌性子代中Nedd4含量均低于相應(yīng)對(duì)照組(P0.05); Grb10基因在各組中都是增高(P0.05); IGF-1R在各組中都是增高,但只有實(shí)驗(yàn)組P20、P60雄性子代中增高明顯(P0.05); Bcl-2除了實(shí)驗(yàn)組P60雌性子代外,其他各組中均明顯降低(P0.05)；實(shí)驗(yàn)組P60雄性子代中caspases3表達(dá)明顯增高(P0.05)；實(shí)驗(yàn)組P60睪丸和卵巢組織中caspases9表達(dá)均增高(P0.05)。二、體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.Vnz作用顆粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Vnz高劑量(28uM)組培養(yǎng)顆粒細(xì)胞雌二醇的分泌量明顯降低(P0.05)；與FSH組相比較FSH+28、FSH+14、FSH+7組雌二醇分泌量均降低(p0.05); FSH+28、FSH+14、FSH+7各組間比較無(wú)顯著性差異(p0.05); E+28、E+14、E+7組雌二醇的分泌量略高于依西美坦單獨(dú)作用時(shí)雌二醇的分泌量,但各組間無(wú)顯著性差異(P0.05); Vnz培養(yǎng)顆粒細(xì)胞3β-HSD和P分泌量與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P0.05);Vnz培養(yǎng)顆粒細(xì)胞加入阻斷劑后其雌二醇的分泌量與對(duì)照組比較差異有顯著性(P0.05);Vnz培養(yǎng)顆粒細(xì)胞IGF-1R的表達(dá)與對(duì)照組比較明顯降低(P0.05)。2.Vnz作用間質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Vnz高劑量(28uM)組培養(yǎng)間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌量明顯降低(P0.05);Vnz高劑量(28uM)組培養(yǎng)間質(zhì)細(xì)胞中cAMP濃度和IGF-1R濃度明顯降低(P0.05)。結(jié)論：1.Vnz對(duì)孕鼠及子代體重增長(zhǎng)沒(méi)有影響；Vnz對(duì)平均產(chǎn)子數(shù)、出生子鼠雌雄比例、出生體重及出生存活率沒(méi)有影響2.Vnz可致F1成年雄性子代精子數(shù)量下降,類固醇激素分泌改變3.Vnz可致F1子代肝臟脂肪變性、睪丸和卵巢組織損傷；4.Vnz對(duì)F1雄性子代和雌性子代的生殖細(xì)胞均有致凋亡作用；csapases3. caspases9可能介導(dǎo)了其凋亡過(guò)程；5.Vnz不影響顆粒細(xì)胞正常的增殖與分化；Vnz通過(guò)抑制卵巢顆粒細(xì)胞IGF-1R的表達(dá),抑制了cAMP-PAK信號(hào)傳導(dǎo)途徑,進(jìn)而抑制了顆粒細(xì)胞分泌E2。6.Vnz通過(guò)抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞IGF-1R的表達(dá),抑制了cAMP-PAK信號(hào)傳導(dǎo)途徑,進(jìn)而抑制間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮。在胚胎性分化關(guān)鍵期暴露Vnz的雄性子代中,Nedd4/Grb10復(fù)合體對(duì)IGF的泛素化降解使其生殖細(xì)胞IGF-1R的表達(dá)下調(diào),從而降低了IGF-1R介導(dǎo)的PI3K/Akt和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)caspases3.9促凋亡的抑制作用,從而促使凋亡增加。推測(cè)Nedd4/Grb10復(fù)合體對(duì)IGF的泛素化降解途徑是胚胎期暴露Vnz導(dǎo)致F 1-F3雄性子代表觀遺傳跨代繼承表型的發(fā)病機(jī)制。Vnz通過(guò)影響生殖細(xì)胞的IGF-1R表達(dá),抑制了類固醇激素合成的cAMP-PAK信號(hào)傳導(dǎo)途徑,進(jìn)而影響生殖細(xì)胞的分泌功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中央民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2446080