【摘要】：花生是一種高脂肪、高蛋白的食物,營養(yǎng)豐富,同時(shí)花生也是一種重要的過敏食物,由花生引發(fā)的過敏反應(yīng)因其癥狀嚴(yán)重、發(fā)病機(jī)率高和死亡人數(shù)多的因素而受到全世界的廣泛關(guān)注。Ara h2是花生過敏原中致敏性最強(qiáng)的蛋白,能被90%以上的過敏患者血清的IgE識(shí)別。Ara h2,作為花生中最主要的過敏原之一,研究并降低其致敏性具有重要意義。 本論文研究工作先從花生中分離純化Ara h2,從雙孢蘑菇中制備多酚氧化酶粗酶液,確定了多酚氧化酶催化交聯(lián)花生Ara h2蛋白的最佳條件,再對(duì)Arah2及其交聯(lián)產(chǎn)物模擬人體胃腸消化,研究其消化性和致敏性的變化,同時(shí)對(duì)其顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究分析,本研究內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面： 1.登入SWISS-MODEL網(wǎng)站,以與Ara h2同源性高達(dá)59%的Ara h6為模版,同源建模,構(gòu)建的Ara h2.01和Ara h2.02的模型都只有一個(gè)。通過軟件對(duì)其過敏原表位和交聯(lián)位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),Ara h2.01的交聯(lián)位點(diǎn)可能有3個(gè),Ara h2.02交聯(lián)位點(diǎn)可能有4個(gè)；而且這些交聯(lián)位點(diǎn)大部分位于Ara h2的三個(gè)主要過敏原表位中的aa60-69、aa70-75之間,因此這些位點(diǎn)上的蛋白交聯(lián)可能對(duì)Ara h2的致敏性影響顯著。 2.優(yōu)化了離子交換柱層析色譜柱一步法純化Ara h2的方法,優(yōu)化條件主要包括降低了梯度洗脫鹽離子濃度、降低了緩沖液pH和選取第二次浸提的粗蛋白,考馬斯亮藍(lán)染色后,灰度掃描結(jié)果顯示其純度大于90%,離子交換層析純化得率為23.31%,重現(xiàn)性好。制備了酶活達(dá)到6000U/mL的多酚氧化酶酶液,可用于后續(xù)的Arah2交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。 3.確定了多酚氧化酶催化交聯(lián)花生過敏原Ara h2的加工條件。多酚氧化酶催化交聯(lián)Ara h2的最適體系為：Ara h2的濃度為1mg/mL,多酚氧化酶酶活終濃度1600U/mL,酶促反應(yīng)條件：50℃,pH7.0,反應(yīng)80分鐘,研究結(jié)果還顯示離子強(qiáng)度對(duì)多酚氧化酶交聯(lián)Ara h2無顯著差異,溫度和酶活對(duì)交聯(lián)反應(yīng)影響顯著。闡明了不同還原劑對(duì)多酚氧化酶催化交聯(lián)Ara h2的作用,發(fā)現(xiàn)高濃度的β-巰基乙醇幾乎能完全抑制酶交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生,且通過改變其濃度可控制交聯(lián)反應(yīng)的程度。 4.系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了花生Ara h2及其交聯(lián)產(chǎn)物的消化性,同時(shí)運(yùn)用顯微學(xué)手段觀察了Ara h2、Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物以及模擬胃腸消化后產(chǎn)物的顯微結(jié)構(gòu),研究發(fā)現(xiàn),Ara h2蛋白抗胃消化但易被腸消化,而Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物相對(duì)可被胃消化,由于形成高聚物使得其腸消化速率比Ara h2有所減慢。顯微研究結(jié)果表明,天然的Ara h2蛋白具有容易聚集的特性,其平均粒徑為287nm,交聯(lián)形成的高聚物平均粒徑則為1705nm；模擬胃腸消化后的電鏡結(jié)果也和激光粒度儀檢測(cè)結(jié)果相吻合,Ara h2經(jīng)過胃消化后,觀察到了粒徑小于287nm且大小不均一的顆粒蛋白存在。交聯(lián)產(chǎn)物胃消化后,觀測(cè)到了殘留Ara h2蛋白；交聯(lián)產(chǎn)物模擬腸消化后,也觀察到了Ara h2和未被完全消化高聚物。 5.采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)花生Ara h2、Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物抗原性和間接ELISA法對(duì)Ara h2、Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物的致敏性進(jìn)行了評(píng)估,結(jié)果表明,與Ara h2相比,Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物在低濃度(0.32μ g/mL)時(shí),Ara h2的抗原性強(qiáng)于Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物的,而在高濃度(≥0.32μ g/mL)時(shí),由于蛋白聚集使得Ara h2的抗原性降低,從而導(dǎo)致Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物的抗原性高于Ara h2,但是兩者并無顯著性差異。而對(duì)Ara h2、Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物IgE結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過交聯(lián)后,Ara h2蛋白的致敏性顯著降低；對(duì)于Ara h2及其交聯(lián)產(chǎn)物模擬胃消化后,IgE結(jié)合能力最強(qiáng)的是Ara h2, Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物次之,最弱的是胃消化后的Ara h2, Ara h2及其交聯(lián)產(chǎn)物模擬腸消化后,IgE結(jié)合能力最強(qiáng)的仍然是Ara h2,腸消化后的Ara h2次之,最弱的是Ara h2交聯(lián)產(chǎn)物。最后研究表明,0.5%的β-巰基乙醇為是控制交聯(lián)的臨界點(diǎn),此時(shí)的致敏性也最低。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R155;Q946.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2404294