【摘要】：第一部分ACR側(cè)腦室注射對大鼠紋狀體與小腦的毒性研究目的：以病理學(xué)改變?yōu)橛^測指標(biāo),采用側(cè)腦室注射染毒方式,探討ACR對紋狀體與小腦MAPKs信號通路、Nrf2及NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的影響。方法：35只成年雄性SD大鼠,體重200 g-220 g,隨機(jī)分為5組,每組7只,即溶劑對照組(人工腦脊液,ACSF),6-羥基多巴胺(6-OHDA) (0.5mg/kg)陽性對照組和ACR低、中、高(0.5、2.5、12.5mg/kg)劑量組。側(cè)腦室雙側(cè)注射后,觀察動物一般行為改變。染毒24 h后處死動物,冰上立即分離紋狀體與小腦,-80℃保存?zhèn)溆�。尼氏染色觀察紋狀體與小腦神經(jīng)元病理改變,免疫組織化學(xué)觀察酪氨酸羥化酶陽性(TH+)細(xì)胞數(shù),Western blot法檢測TH蛋白表達(dá),TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡,分光光度計(jì)法測定MDA水平,酶標(biāo)法測定GSH含量,ELISA法測定TNF-α、IL-6水平,Western blot法檢測MAPKs各蛋白表達(dá),免疫熒光技術(shù)觀察Nrf2與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)。結(jié)果：(1)一般行為改變：染毒次日,高劑量及陽性對照組動物出現(xiàn)輕度步態(tài)紊亂現(xiàn)象。(2) Nissl染色：與溶劑對照組相比,中、高劑量及陽性對照組紋狀體神經(jīng)元與小腦蒲肯野細(xì)胞層尼氏體減少、細(xì)胞腫脹、排列疏松紊亂。(3)TH表達(dá)：與溶劑對照組比較,免疫組化結(jié)果顯示高劑量及陽性對照組紋狀體與小腦TH+細(xì)胞數(shù)均減少(P0.05); Western blot結(jié)果表明ACR各劑量與陽性對照組紋狀體TH蛋白水平均降低(P0.01),高劑量與陽性對照組小腦TH蛋白表達(dá)亦減少(P0.01)。(4)神經(jīng)元凋亡：高劑量及陽性對照組紋狀體與小腦TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目較溶劑對照組顯著上升(P0.05)。(5)氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)：與溶劑對照組相比,中劑量組紋狀體與高劑量組小腦MDA含量顯著升高(P0.05); ACR各劑量及陽性對照組紋狀體與小腦GSH含量顯著降低(P0.01)。與溶劑對照組相比,紋狀體內(nèi)TNF-a含量在高劑量與陽性對照組顯著增加(P0.05),IL-6僅在中劑量組明顯升高(P0.05)；小腦內(nèi)TNF-a含量在高劑量組顯著升高(P0.05),IL-6含量在高劑量及陽性對照組顯著上升(P0.01)。(6) MAPKs信號通路：與溶劑對照組比較,小腦內(nèi)高劑量組p-ERK1/2,陽性對照組p-JNK1/2,中、高劑量與陽性對照組p-p38蛋白表達(dá)均顯著升高(P0.05);紋狀體內(nèi)陽性對照組p-ERK1/2、高劑量組p-JNK1/2、中劑量組p-p38蛋白表達(dá)均顯著增加(P0.05)。(7)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子：免疫熒光結(jié)果顯示與溶劑對照組比較,高劑量與陽性對照組紋狀體Nrf2表達(dá)顯著上升(P0.05);中、高劑量組小腦Nrf2表達(dá)亦顯著增加(P0.01)。(8) NF-κB轉(zhuǎn)錄因子：免疫熒光結(jié)果顯示與溶劑對照組比較,中、高劑量及陽性對照組紋狀體NF-κB表達(dá)均顯著增加(P0.05)；高劑量與陽性對照組小腦NF-κB表達(dá)顯著升高(P0.01)。結(jié)論：本研究建立ACR側(cè)腦室注射神經(jīng)毒性動物模型,發(fā)現(xiàn)0.5 mg/kg ACR側(cè)腦室注射未引起紋狀體與小腦神經(jīng)元病理改變;2.5 mg/kg ACR側(cè)腦室注射均可致紋狀體與小腦神經(jīng)元病理改變及多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目減少;12.5 mg/kg ACR染毒除引起上述改變外,還誘導(dǎo)紋狀體與小腦神經(jīng)元凋亡,大鼠出現(xiàn)輕微步態(tài)改變。此外,ACR可誘導(dǎo)紋狀體與小腦氧化應(yīng)激與細(xì)胞炎性因子水平增加,激活MAPKs信號通路,促進(jìn)Nrf2及NF-κB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加。第二部分 ACR對PC12細(xì)胞的毒性作用及分子機(jī)制研究目的：以細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)作為觀測指標(biāo),觀察ACR對PC12細(xì)胞的毒性效應(yīng)。通過特異性抑制劑與siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù),探討ACR細(xì)胞毒性中MAPKs、Nrf2與NF-κB信號通路的激活及三條通路之間的cross-talk,以此闡明ACR毒性作用的分子機(jī)制。方法：細(xì)胞染毒：0.6、1.25、2.5、5mmol/L ACR處理PC12細(xì)胞12h或24h。抑制劑或細(xì)胞轉(zhuǎn)染：抑制劑(10μmol/L U0126、20μmol/L SP600125.10μmol/L SB202190、5μmol/L BAY 11-7082)分別預(yù)處理細(xì)胞2h或細(xì)胞轉(zhuǎn)染(20 nmol/L control siRNA或Nrf2 siRNA) 4h后,2.5 mmol/L ACR再染毒24 h。MTT法檢測細(xì)胞活力,相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),DCFH-DA熒光探針法檢測ROS生成,分光光度計(jì)測定MDA含量,酶標(biāo)法測定GSH水平與GSH-Px活力,ELISA法檢測細(xì)胞因子TNF-a、IL-6水平,免疫熒光檢測Nrf2與NF-κB核轉(zhuǎn)位,Western blot測定胞漿胞核Nrf2、keap1、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá),以及胞漿胞核NF-κB、 IκBa、TNF-a、COX-2蛋白表達(dá),RT-PCR檢測HO-1、NQO-1、TNF-a、IL-6的mRNA表達(dá)。結(jié)果：(1)細(xì)胞活力：與對照組相比,在不同劑量ACR暴露12h后細(xì)胞活力均未發(fā)生顯著性改變。2.5、5 mmol/L ACR暴露24h可致細(xì)胞數(shù)目減少,神經(jīng)突收縮,貼壁能力降低,胞體呈球狀,且細(xì)胞活力顯著降低(P0.01),呈現(xiàn)較好的時間-劑量效應(yīng)關(guān)系。(2)氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)：與對照組相比,2.5、5 mmol/L ACR組細(xì)胞ROS與MDA水平均顯著增加(P0.05), GSH含量在1.25、2.5、5 mmol/L ACR組顯著降低(P0.05); TNF-a含量及mRNA水平在2.5、5 mmol/L ACR作用后顯著增加(P0.05),IL-6含量及mRNA水平僅在5 mmol/L ACR作用下顯著升高(P0.01)。提示ACR可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激與炎性反應(yīng)。(3) MAPKs信號通路：2.5、5 mmol/L ACR可使p-JNK1/2與p-p38蛋白表達(dá)較對照組顯著增加(P0.05)。提示ACR可激活JNK與p38通路,且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。抑制劑試驗(yàn)表明,較2.5 mmol/L ACR組,MEK抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑SB202190分別預(yù)處理均致Nrf2與NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05),并減少Nrf2與NF-κB通路下游靶基因HO-1、NQO-1、 TNF-a的mRNA表達(dá)(P0.05)。提示MAPKs通路阻斷可抑制ACR誘導(dǎo)的Nrf2與NF-κB通路的活化。(4)Nrf2信號通路：免疫熒光結(jié)果表明ACR各劑量組Nrf2出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,Western blot結(jié)果表明ACR各劑量組胞核Nrf2蛋白水平較對照組顯著增加(P0.01)；伴侶蛋白keapl蛋白表達(dá)較對照組在5 mmol/L ACR作用下顯著升高(P0.01)；Nrf2通路下游調(diào)控囚子HO-1蛋白水平在0.6、1.25.2.5 mmol/L ACR作用下較對照組顯著上升(P0.05), NQO-1蛋白表達(dá)在1.25、2.5、5 mmol/L ACR作用下較對照組亦顯著增加(P0.05)。提示ACR可誘導(dǎo)Nrf2信號通路的活化,且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。RNA干擾試驗(yàn)顯示,與siRNA對照組比較,Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白水平顯著降低(P0.01)。提示Nrf2基因沉默可抑制ACR誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活化。(5) NF-κB信號通路：免疫熒光結(jié)果顯示2.5、5 mmol/L ACR組NF-κB出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,Western blot結(jié)果顯示胞核NF-κB蛋白表達(dá)在1.25、2.5、5 mmol/LACR處理后較對照組顯著升高(P0.05)；伴侶蛋白IκBa蛋白表達(dá)在0.6、1.25、2.5 mmol/L ACR作用下較對照組顯著升高(P0.05); NF-κB通路下游調(diào)控因子TNF-a、COX-2蛋白水平均在2.5、5 mmol/L ACR作用下較對照組顯著上升(P0.05)。提示ACR可活化NF-κB信號通路,且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。抑制劑試驗(yàn)表明,較2.5 mmol/L ACR組,NF-κB通路抑制劑BAY11-7082預(yù)處理可致Nrf2蛋白水平顯著降低(P0.01)。提示NF-κB通路阻斷可抑制ACR誘導(dǎo)的Nrf2轉(zhuǎn)錄因子活化。結(jié)論：ACR在2.5、5 mmol/L劑量下作用24 h呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性,且具有劑量效應(yīng)關(guān)系,表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)發(fā)生。其可能涉及的分子機(jī)制包括ACR激活MAPKs信號通路(JNK、p38通路)：ACR促進(jìn)keap1-Nrf2解離與核轉(zhuǎn)位,促使靶基因HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)增加;ACR引起IkBα-NF-κB解離與核轉(zhuǎn)位,上調(diào)下游基因TNF-a、COX-2蛋白表達(dá)。在ACR細(xì)胞毒性中,MAPKs、Nrf2與NF-κB之間存在cross-talk,表現(xiàn)為MAPKs通路對Nrf2與NF-κB具有調(diào)控作用,而Nrf2與NF-κB之間存在雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)。第三部分JNK與p38對ACR致PC12細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制研究目的：以細(xì)胞凋亡為觀測終點(diǎn),探討線粒體凋亡通路是否參與ACR誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。采用特異性阻斷劑研究JNK與p38信號通路對線粒體介導(dǎo)凋亡的調(diào)控作用,為尋找ACR中毒的防治靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。方法：細(xì)胞染毒：0.6、1.25、2.5、5mmol/L ACR處理細(xì)胞24 h。抑制劑：U0126、SP600125、SB202190分別預(yù)處理2h后,2.5mmol/L ACR再染毒24 h。Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡,透射電鏡觀察細(xì)胞與線粒體超微結(jié)構(gòu),流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率,JC-1染色檢測線粒體膜電位改變,Western blot檢測Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素c、caspase-9與caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果：(1)細(xì)胞凋亡：2.5、5 mmol/L ACR作用使DNA裂解,細(xì)胞核異染色體聚集；與對照組比較,2.5、5 mmol/L ACR處理可致細(xì)胞早期與晚期凋亡率均顯著升高(P0.05)。(2)線粒體膜電位與超微結(jié)構(gòu)改變：與對照組比較,2.5、5 mmol/L ACR處理可致線粒體膜電位顯著降低(P0.01); 2.5 mmol/L ACR作用可使線粒體腫脹,甚至嵴斷裂。(3)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)：與對照組相比,1.25、2.5、5 mmol/L ACR均可致Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05), Bax蛋白水平在2.5、5 mmol/L ACR作用下顯著增加(P0.05),細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)在0.6、1.25、2.5 mmol/LACR作用下均顯著升高(P0.01)。(4) caspase級聯(lián)反應(yīng)：與對照組相比,2.5、5 mmol/LACR作用可致caspase-9, caspase-3酶原顯著降低(P0.05), caspase-9、caspase-3活化片段顯著增加(P0.01)。(5)JNK與p38通路對線粒體介導(dǎo)凋亡的調(diào)節(jié)：與ACR組相比,ACR+SP600125組Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P0.05), Bax與細(xì)胞色素c蛋白水平降低(P0.01),線粒體膜電位顯著升高(P0.01),細(xì)胞早期與晚期凋亡率均顯著減少(P0.05);較ACR組,ACR+SB202190組僅Bcl-2蛋白表達(dá)增加(P0.05),且細(xì)胞早期凋亡減少(P0.05)。提示JNK與p38通路阻斷均可通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路降低ACR誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡,其中JNK通路阻斷對ACR誘導(dǎo)的凋亡的抑制更明顯。結(jié)論：ACR在2.5、5 mmol/L劑量下處理24 h可致PC12細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)異常及線粒體膜電位降低,啟動線粒體凋亡通路,激活caspase級聯(lián)反應(yīng),最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JNK與p38對線粒體凋亡通路具有調(diào)節(jié)作用,抑制JNK與p38通路可降低ACR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這為ACR中毒的防治提供了分子靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114
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本文編號：
2376316
