【摘要】：氟絡(luò)草酮(Fluorochloridone, FLC)是一種吡咯烷酮類除草劑,化學(xué)名稱為(3RS,4RS;3RS,4RS)-3-氯-4-氯甲基-1-(α,α,α-三氟間甲基)-2-吡咯烷酮。FLC在歐盟和北美國家中廣泛應(yīng)用,國內(nèi)也已經(jīng)引入該藥,已在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)(ICAMA)獲得臨時登記。文獻公布的FLC毒性研究資料非常少,僅JOURNAL OF ANDROLOGY在1986年發(fā)表的兩篇會議文摘,指出FLC可引起雄性大鼠出現(xiàn)睪丸萎縮,精子數(shù)量和質(zhì)量下降,血清卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone, FSH)升高,生殖功能下降。2010年底,歐洲食品安全局(European Food Safety Authority (EFSA))公布的FLC毒性評價報告指出,FLC具有可能的雄性生殖毒性,其毒作用靶器官是睪丸與附睪,主要表現(xiàn)為精子數(shù)量下降、異常增多,Sertoli細胞(支持細胞)空泡化。2011年3月,歐盟委員會健康與消費者保護總司在發(fā)布的報告中指出FLC是可能的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。本課題的研究目的包括評價FLC對SD大鼠睪丸的影響、FLC誘導(dǎo)生精細胞凋亡及其可能機制探索和FLC對Sertoli細胞的損傷作用。通過建立SD雄性大鼠FLC暴露模型和Sertoli--生精細胞共培養(yǎng)、原代培養(yǎng)Sertoli細胞模型,評價FLC的睪丸毒性,探究其發(fā)生的主要通路機制,為FLC健康危險度評價提供基礎(chǔ)資料,并為認識類似結(jié)構(gòu)除草劑的生殖毒性提供借鑒。一、FLC對SD大鼠睪丸的影響40只SD雄性大鼠隨機分為溶劑對照組和FLC低(30 mg/kg bw/d)?中(150 mg/kg bw/d)、高(750 mg/kg bw/d)劑量組,每組10只。SD大鼠經(jīng)灌胃染毒,給藥容劑為1mL/100g bw,每日一次,連續(xù)灌胃給藥28天。染毒結(jié)束后,運用睪丸組織病理檢查、曲細精管超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察、附睪尾精子計數(shù)和血清睪酮(Testoterone, T)水平等指標,評價FLC的睪丸毒性。應(yīng)用試劑盒檢測睪丸組織中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、過氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(Glutathioereductase,GSH-GR)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GSH-ST)水平。1.FLC影響睪丸組織氧化應(yīng)激平衡。其中,中、高劑量組脂質(zhì)過氧化標志物MDA含量明顯增加,各劑量組GSH含量均明顯下降,與對照比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05或p0.001)。抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px,GSH-GR和GSH-ST,均在FLC的影響下出現(xiàn)了不同程度的活力下降,其中高劑量組與對照組相比,以上抗氧化酶活力均出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的下降(p0.05或p0.001)；中劑量組除GSH-GR外,其它的抗氧化酶均出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的活力下降(p0.05或p0.001)；低劑量組只有CAT和SOD活力顯著降低(p0.05或p0.001)。2.FLC對SD大鼠睪丸毒性主要表現(xiàn)為,高劑量組大鼠睪丸質(zhì)量、睪丸臟器系數(shù)、附睪質(zhì)量、血清T水平和附睪尾精子計數(shù)與對照相比顯著下降(p0.05或p0.001)。睪丸組織病理檢查：中、高劑量組大鼠睪丸出現(xiàn)不同程度的損傷,包括1)間質(zhì)水腫；2)曲細精管結(jié)構(gòu)改變,萎縮；3)曲細精管生精上皮退化變性,生精細胞脫落至曲細精管管腔面；4)精母細胞、精子細胞死亡,管腔內(nèi)出現(xiàn)多核巨細胞；5)部分曲細精管內(nèi)的生精細胞耗竭；6)支持細胞空泡化；7)生精細胞細胞核損傷。曲細精管電鏡觀察顯示生精細胞碎裂,精子細胞核仁、線粒體結(jié)構(gòu)異常。睪丸質(zhì)量,睪丸臟器系數(shù)、附睪質(zhì)量、附睪尾精子計數(shù)、血清睪酮和睪丸組織病理學(xué)檢查的基準劑量95%置信區(qū)間下限值(95% lower confidence limit of benchmark dose, BMDL)分別為：65.7、76.0、23、2.4、99.9和12.9 mg/kg bw/d。因此,本研究中附睪尾精子計數(shù)和睪丸組織病理損傷是對FLC暴露較為敏感的指標。二、FLC誘導(dǎo)原代培養(yǎng)Sertoli-生精細胞凋亡及其可能信號通路機制選擇出生后28-30天的雄性SD大鼠,采用兩步酶消化法制備Sertoli-生精細胞原代共培養(yǎng)體系。設(shè)立0.1%二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)溶劑對照組和3個FLC劑量組(10-8、10-7和10-6M)。實驗結(jié)果顯示：1.按以上劑量染毒6和24h后,開展四甲基偶氮唑鹽(Thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT)試驗和生精細胞脫落計數(shù),結(jié)果顯示,相對溶劑對照組,染毒6h后,高劑量組細胞活力降至84.76±4.91(%),染毒24 h后,各劑量組細胞活力分別降至72.16±2.53、50.62±4.13和44.30±12.66(%)(p0.001)。FLC染毒6、12、24和48 h后,各劑量組生精細胞脫落相對溶劑對照組,均顯著增加(p0.05或p0.001),且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系和時間-劑量關(guān)系。2.FLC染毒24 h后,收集劑量組與溶劑對照組脫落的生精細胞和培養(yǎng)的貼壁細胞(包括貼壁培養(yǎng)的Sertoli細胞和黏附于其上的生精細胞),用annexin Ⅴ結(jié)合試驗檢測各組細胞凋亡情況。與各自的溶劑對照組相比,各劑量組脫落的生精細胞中,早期凋亡細胞百分比明顯增高至24.25±2.88,33.08±2.43和29.23±2.54(%),晚期凋亡／壞死細胞百分比明顯增高至17.35±1.16,23.14±1.06和20.70±0.48(%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05或p0.001)。各劑量組共培養(yǎng)的Sertoli-生精細胞與對照組相比,早期凋亡細胞百分比顯著增加至10.80±1.86,13.52±0.72和16.62±0.35(%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05或p0.001),但晚期凋亡／壞死細胞百分比沒有顯著性改變。3.FLC染毒24、48和72h后,對Sertoli-生精細胞共培養(yǎng)體系中Fas/FasL、線粒體凋亡信號通路,以及核因子活化B細胞K輕鏈增強子(Nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells, NFκB)、促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路相關(guān)基因表達的影響。FLC染毒24 h使中劑量組半胱氨酸的冬氨酸蛋白水解酶(Cysteiny1 aspartate specific proteinase, caspase)8基因表達水平明顯升高(p=0.006)；染毒24、48與72h后,高、中、低劑量組均使B淋巴細孢瘤基因-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表達水平不同程度顯著下降(p0.05或p0.001),呈劑量-反應(yīng)關(guān)系和時間-反應(yīng)關(guān)系；FLC也上調(diào)了Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)、Bcl-2相關(guān)死亡啟動子(Bcl-2-Associa ted Death promoter, Bad)、細胞色素c (Cytochrome c)、caspase 9和caspase 3基因的表達水平。FLC染毒72 h后,中、高劑量組NFκB家族成員P50、P65基因表達顯著上調(diào)(p0.05或p0.001)。而高劑量FLC染毒24 h即可使高劑量組p38 MAPK基因表達明顯增加(p=0.014),染毒48和72h,各劑量組p38絲裂素活化蛋白激酶(p38-Mitogen activated protein kinase, p38 MAPK)基因表達都顯著增加(p0.05或p0.001),FLC對p38 MAPK基因表達的影響呈劑量-反應(yīng)和時間-反應(yīng)關(guān)系。三、FIC對大鼠原代培養(yǎng)Sertoli細胞的毒作用選擇出生后18-21天的雄性SD大鼠,采用兩步酶消化制備Sertoli-生精細胞,細胞接種24h后,用20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)低滲處理,純化Sertoli細胞,建立Sertoli細胞原代培養(yǎng)體系。通過原代Sertoli細胞生長曲線,確定純化后第2天開始對數(shù)生長期。設(shè)立0.1% DMSO溶劑對照組和3個FLC劑量組(10-、10-7和10-6M)。1.按以上劑量染毒6、12和24h后,開展MTT試驗。染毒12h中、高劑量組原代培養(yǎng)Sertoli細胞增殖活力明顯下降(p0.001)。染毒24 h各劑量組細胞增殖活力分別降至74.7±2.5、56.1±4.4和52.3±6.4(%)(p0.05或p0.001),呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。2.免疫熒光染色試驗顯示,FLC染毒6、12、24、48與72h,緊密連接(Tight junction, TJ)的重要組成蛋白封閉蛋白(Occludin)與閉鎖小環(huán)蛋白-1(Zonula occludens-1,ZO-1)水平發(fā)生變化。染毒6h,中、高劑量組Occludin蛋白水平明顯變化(p≤0.001)。染毒24和48h,各劑量組誘導(dǎo)Occludin水平更明顯下降(p0.05或p0.001)。高劑量染毒24h使Occludin基因表達顯著下調(diào)(p=0.006)。FLC處理原代培養(yǎng)Sertoli細胞12h,中、高劑量組ZO-1蛋白表達顯著下調(diào)(p0.001)。染毒24和48h,各劑量組誘導(dǎo)ZO-1表達下降更為明顯(p0.05或p0.001),呈劑量依賴性。染毒24、48與72h中、高劑量組ZO--1基因表達顯著下調(diào)(p0.05),ZO-1基因水平隨著FLC濃度的增加而降低,呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。3.按以上劑量染毒6、12、24、48與72h,FLC對原代培養(yǎng)Sertoli細胞分泌功能相關(guān)基因表達有不同程度的影響。染毒24、48和72h,各劑量雄激素結(jié)合蛋白(Androgen binding protein, ABP)基因表達隨劑量增加而下調(diào)；染毒6、12和72h,高劑量組轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin, Tf)基因表達顯著下調(diào)(p0.05)。FEC染毒24和48h抑制素B(Inhibin B, INHB)基因表達隨FLC濃度的增加而降低,呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系且各劑量組INHB基因表達與其相應(yīng)的溶劑對照組相比有顯著下調(diào)(p0.05或p0.001)。染毒72h,只有高劑量組INHB基因表達明顯下調(diào)(p=0.031)。總結(jié)上述實驗結(jié)果,FLC染毒28天可使SD雄性大鼠睪丸組織氧化應(yīng)激水平升高、降低血清睪酮水平、睪丸曲細精管生精上皮退行性改變、Sertoli細胞空泡化,含吞噬小體的多核巨細胞增多,附睪尾精子計數(shù)下降。FLC可通過抑制Bc1-2和上調(diào)Bax和Bad基因表達,使Sertoli-生精細胞共培養(yǎng)體系內(nèi)生精細胞發(fā)生凋亡。內(nèi)源性凋亡信號通路可能是其主要的凋亡機制之一。同時NFκB和p38 MAPK信號通路也可能通過抑制抗凋亡基因Bcl-2和／或上調(diào)促凋亡蛋白基因Bax和Bad表達,參與調(diào)節(jié)FLC引起的Sertoli-生精細胞共培養(yǎng)體系中細胞凋亡。在原代培養(yǎng)Sertoli細胞中,FLC降低了TJs結(jié)構(gòu)蛋白Occludin與ZO-1水平,影響B(tài)TB結(jié)構(gòu)完整性；同時Sertoli細胞旁分泌的重要蛋白一--ABP、Tf和INHB相關(guān)基因表達也在FLC影響下下調(diào)。說明FLC對Sertoli細胞存在毒作用。由此,我們提出FLC睪丸毒性的可能機制是：1)誘導(dǎo)睪丸組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激,損傷睪丸組織結(jié)構(gòu)的完整性,破壞生精過程需要的特定微環(huán)境；2)直接作用于生精細胞,通過內(nèi)源性信號通路主導(dǎo),NFκB信號通路和p38MAPK信號通路協(xié)助,誘導(dǎo)生精細胞凋亡,破壞正常的生精過程；3)影響Sertoli細胞TJs結(jié)構(gòu)蛋白表達,破壞BTB結(jié)構(gòu)完整性；使Sertoli細胞旁分泌功能受損,無法維持曲細精管內(nèi)生精細胞分化生長所需的高濃度睪酮和鐵,干擾生精過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【參考文獻】

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1 高瑞娟;睪丸間質(zhì)細胞睪酮生物合成的局部調(diào)節(jié)[J];國外醫(yī)學(xué)(計劃生育分冊);2000年02期

2 孫鈺銘;趙士光;陳小玉;;醋酸鉛對大鼠睪丸支持細胞雄激素結(jié)合蛋白、抑制素和轉(zhuǎn)鐵蛋白mRNA表達的影響[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年04期

3 陳日萍;陳彤;俞少勇;顧劉金;張幸;;17種除草劑對雄性大鼠睪丸生殖毒性的比較[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2007年05期

4 徐華;黃潔;李敏;高志斌;朱彥鋒;李云;;小鼠睪丸體外培養(yǎng)模型研究鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯對睪酮合成及機制的影響[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年04期

5 梁誠;;含氟農(nóng)藥的研究開發(fā)與生產(chǎn)應(yīng)用(下)[J];新農(nóng)藥;2005年03期

6 錢伯章;;我國農(nóng)藥產(chǎn)量躍居世界第一[J];農(nóng)藥研究與應(yīng)用;2008年02期

7 權(quán)伍榮;郭環(huán)宇;任大勇;沈明浩;;除草劑百草枯對大鼠及胎兒的毒性研究[J];食品科學(xué);2007年10期

8 李煥婷;秦占芬;秦曉飛;夏f^娟;徐曉白;馬保華;;除草劑西瑪津?qū)Ψ侵拮干婧托韵侔l(fā)育的影響[J];生態(tài)毒理學(xué)報;2008年03期

9 張林龍;;化學(xué)除草劑:生態(tài)環(huán)境的殺手[J];生態(tài)經(jīng)濟;2012年11期

10 劉輝;張_g;;細胞核因子-κB在睪丸生精細胞凋亡過程中的活化作用[J];臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

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本文編號：2299058