發(fā)布時間：2018-10-23 07:51

【摘要】：目的:以能夠內(nèi)源性合成n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFAs)的fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠為研究對象,腹腔注射致癌劑氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)誘導結(jié)腸腫瘤。對比高脂肪飲食(high fat diet,HFD)和正常飲食(normal fat diet,NFD)的野生型小鼠的結(jié)腸腫瘤負荷的不同,以及對比高脂肪飲食的野生型小鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)腸腫瘤負荷的差異,明確高脂肪飲食促進致癌劑誘導的腸腫瘤形成和n-3 PUFAs抑制腸腫瘤形成作用。檢測結(jié)腸組織炎癥相關(guān)基因表達,檢測n-3 PUFAs---二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)對巨噬細胞表型和結(jié)腸細胞HT-29炎癥通路的影響,綜合分析n-3 PUFAs抑制腸腫瘤作用機制。方法:(1)實驗小鼠分為3組,攝入含10%紅花籽油的正常飼料(normal fat diet,NFD)的野生型小鼠組(WT+NFD)、含10%紅花籽油和20%豬油的高脂肪飼料(high fat diet,HFD)的野生型小鼠組(WT+HFD)、含10%紅花籽油和20%豬油的高脂肪飲食的fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠(fat-1+HFD)。10mg/kg′bw AOM腹腔注射,每周一次、持續(xù)六次,喂養(yǎng)22周誘導小鼠結(jié)腸腫瘤形成。fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠的特點是轉(zhuǎn)入了fat-1基因,攝入含n-6 PUFAs豐富的紅花籽油、可內(nèi)源性合成n-3 PUFAs。記錄各組小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量,計算腫瘤發(fā)生率和腫瘤負擔。取遠端結(jié)腸組織行組織病理學分析,氣相色譜法檢測脂肪酸含量,免疫組化法檢測PCNA水平以對結(jié)腸細胞的增殖情況進行鑒定,實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RTPCR)法檢測結(jié)腸組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、癌基因c-myc、巨噬細胞標記物F4/80 mRNA表達水平,蛋白印跡法檢測抑癌基因p53、凋亡相關(guān)蛋白caspase 3及其活性形式cleaved caspase 3水平,炎癥通路相關(guān)蛋白p-GSK3β、β-catenin、NF-κB、p-NF-κB、STAT3、p-STAT3、NLRP3水平。(2)以人單核細胞THP1為研究對象,100ng/ml佛波酯(Phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)誘導THP1細胞分化為M0型巨噬細胞。不同濃度DHA(0-40μM)預處理M0巨噬細胞24h后,100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激M0型巨噬細胞18h,q RT-PCR法檢測巨噬細胞(M0)IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達水平。100ng/ml LPS、50ng/ml IFN-γ聯(lián)合孵育M0型巨噬細胞誘導分化成M1型巨噬細胞,不同濃度DHA孵育M1型巨噬細胞。q RT-PCR法檢測M1型巨噬細胞細胞標記物IL-6、TNF-α、IL-1β、CCR7 mRNA水平和M2型巨噬細胞標記物CCL4、CD206 mRNA水平。(3)以人結(jié)腸癌細胞HT-29為研究對象,50ng/ml TNF-α處理HT-29細胞1h,q RT-PCR和蛋白印跡法分別檢測IL-8、IL-1β,蛋白印跡法檢測胞漿和胞核炎癥通路蛋白NF-κB、p-NF-κB和細胞內(nèi)ERK1/2、p38MAPK、JNK、Akt及其磷酸化水平。為研究DHA對TNF-α誘導HT-29細胞NF-κB活化的影響,不同濃度DHA預孵育HT-29細胞24 h后,50ng/ml TNF-α處理HT-29細胞1 h,qRT-PCR檢測IL-8 mRNA,蛋白印跡法檢測IL-1β和ERK1/2、p38MAPK、JNK、Akt及其磷酸化蛋白,以及胞漿和胞核中NF-κB、p-NF-κB水平。結(jié)果:(1)WT+HFD組小鼠結(jié)腸腫瘤負荷高于WT+NFD組,而fat-1+HFD組則低于WT+HFD。根據(jù)氣相色譜結(jié)果,野生型小鼠結(jié)腸組織n-6/n-3 PUFAs比值明顯高于fat-1小鼠。qRT-PCR分析表明,WT+HFD組結(jié)腸組織炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β明顯高于WT+NFD和fat-1+HFD組。蛋白印跡結(jié)果顯示,WT+HFD組pGSK3β、β-catenin、NF-κB、p-NF-κB、p-STAT3、NLRP3等炎癥通路蛋白表達明顯高于WT+NFD小鼠和fat-1+HFD小鼠。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),WT+HFD組小鼠PCNA表達高于WT+NFD組和fat-1+HFD組。蛋白印跡分析顯示,WT+HFD組結(jié)腸組織凋亡相關(guān)蛋白caspase 3活性形式cleaved caspase 3水平明顯低于WT+NFD和fat-1+HFD組。qRT-PCR結(jié)果表明,WT+HFD小鼠癌基因c-myc mRNA水平明顯高于WT+NFD小鼠和fat-1+HFD小鼠。(2)細胞實驗結(jié)果顯示,DHA降低巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA水平,抑制M1型巨噬細胞標記物TNF-α、IL-1β、IL-6、CCR7 mRNA表達,增強M2型標記物CCL4 mRNA表達。(3)DHA抑制TNF-α處理的結(jié)腸HT-29細胞炎癥因子IL-1β、IL-8表達及其ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt表達,抑制NF-κB的活化。結(jié)論:(1)高脂肪飲食上調(diào)TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3、GSK3β/β-catenin/c-myc炎癥信號通路、促進NLRP3炎癥小體的形成、增加AOM誘導的小鼠腸腫瘤發(fā)生。(2)n-3 PUFAs降低小鼠腸組織TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3炎癥通路相關(guān)蛋白表達、抑制NLRP3表達、拮抗高脂肪飲食小鼠結(jié)腸腫瘤形成。(3)n-3 PUFAs(DHA)抑制巨噬細胞炎癥因子產(chǎn)生、誘導巨噬細胞表型向M2型轉(zhuǎn)變。(4)n-3 PUFAs(DHA)下調(diào)Akt和MAPK信號通路、抑制TNF-α刺激HT-29細胞NF-κB的活化。綜上,n-3 PUFAs可抑制高脂肪飲食小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生,該作用與抑制炎癥信號通路、誘導巨噬細胞表型向M2轉(zhuǎn)變有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：寧波大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R151

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 Kazuki Moro;Masayuki Nagahashi;Rajesh Ramanathan;Kazuaki Takabe;Toshifumi Wakai;;Resolvins and omega three polyunsaturated fatty acids: Clinical implications in inflammatory diseases and cancer[J];World Journal of Clinical Cases;2016年07期

2 Yong-heng Sui;Wen-jing Luo;Qin-Yu Xu;jing hua;;Dietary saturated fatty acid and polyunsaturated fatty acid oppositely affect hepatic NOD-like receptor protein 3 inflammasome through regulating nuclear factor-kappa B activation[J];World Journal of Gastroenterology;2016年08期

3 Wanqing Chen;Rongshou Zheng;Hongmei Zeng;Siwei Zhang;Jie He;;Annual report on status of cancer in China, 2011[J];Chinese Journal of Cancer Research;2015年01期

4 Qing-Chao Zhu;Ren-Yuan Gao;Wen Wu;Bo-Min Guo;Jia-Yuan Peng;Huan-Long Qin;;Effect of a high-fat diet in development of colonic adenoma in an animal model[J];World Journal of Gastroenterology;2014年25期

5 Carlos Sostres;Carla Jerusalen Gargallo;Angel Lanas;;Aspirin, cyclooxygenase inhibition and colorectal cancer[J];World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics;2014年01期

6 吳瓊;郭蒙;葉華;朱宇珍;鄭學寶;;潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌中AOM/DSS模型應用研究[J];海南醫(yī)學;2013年19期

7 劉宣;李丹光;周利紅;王炎;殷佩浩;季青;范忠澤;李琦;;COX-2/PGE_2激活Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控人腸癌細胞VEGF表達[J];第二軍醫(yī)大學學報;2012年11期

8 ;Probiotics inhibit TNF-α-induced interleukin-8 secretion of HT29 cells[J];World Journal of Gastroenterology;2004年03期

，

本文編號：2288573