【摘要】：目的:以能夠內(nèi)源性合成n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFAs)的fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠及野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠為研究對(duì)象,腹腔注射致癌劑氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤。對(duì)比高脂肪飲食(high fat diet,HFD)和正常飲食(normal fat diet,NFD)的野生型小鼠的結(jié)腸腫瘤負(fù)荷的不同,以及對(duì)比高脂肪飲食的野生型小鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)腸腫瘤負(fù)荷的差異,明確高脂肪飲食促進(jìn)致癌劑誘導(dǎo)的腸腫瘤形成和n-3 PUFAs抑制腸腫瘤形成作用。檢測(cè)結(jié)腸組織炎癥相關(guān)基因表達(dá),檢測(cè)n-3 PUFAs---二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)對(duì)巨噬細(xì)胞表型和結(jié)腸細(xì)胞HT-29炎癥通路的影響,綜合分析n-3 PUFAs抑制腸腫瘤作用機(jī)制。方法:(1)實(shí)驗(yàn)小鼠分為3組,攝入含10%紅花籽油的正常飼料(normal fat diet,NFD)的野生型小鼠組(WT+NFD)、含10%紅花籽油和20%豬油的高脂肪飼料(high fat diet,HFD)的野生型小鼠組(WT+HFD)、含10%紅花籽油和20%豬油的高脂肪飲食的fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠(fat-1+HFD)。10mg/kg′bw AOM腹腔注射,每周一次、持續(xù)六次,喂養(yǎng)22周誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸腫瘤形成。fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)入了fat-1基因,攝入含n-6 PUFAs豐富的紅花籽油、可內(nèi)源性合成n-3 PUFAs。記錄各組小鼠結(jié)腸腫瘤數(shù)量,計(jì)算腫瘤發(fā)生率和腫瘤負(fù)擔(dān)。取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織行組織病理學(xué)分析,氣相色譜法檢測(cè)脂肪酸含量,免疫組化法檢測(cè)PCNA水平以對(duì)結(jié)腸細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行鑒定,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RTPCR)法檢測(cè)結(jié)腸組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、癌基因c-myc、巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80 mRNA表達(dá)水平,蛋白印跡法檢測(cè)抑癌基因p53、凋亡相關(guān)蛋白caspase 3及其活性形式cleaved caspase 3水平,炎癥通路相關(guān)蛋白p-GSK3β、β-catenin、NF-κB、p-NF-κB、STAT3、p-STAT3、NLRP3水平。(2)以人單核細(xì)胞THP1為研究對(duì)象,100ng/ml佛波酯(Phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)誘導(dǎo)THP1細(xì)胞分化為M0型巨噬細(xì)胞。不同濃度DHA(0-40μM)預(yù)處理M0巨噬細(xì)胞24h后,100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激M0型巨噬細(xì)胞18h,q RT-PCR法檢測(cè)巨噬細(xì)胞(M0)IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)水平。100ng/ml LPS、50ng/ml IFN-γ聯(lián)合孵育M0型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化成M1型巨噬細(xì)胞,不同濃度DHA孵育M1型巨噬細(xì)胞。q RT-PCR法檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)記物IL-6、TNF-α、IL-1β、CCR7 mRNA水平和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CCL4、CD206 mRNA水平。(3)以人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29為研究對(duì)象,50ng/ml TNF-α處理HT-29細(xì)胞1h,q RT-PCR和蛋白印跡法分別檢測(cè)IL-8、IL-1β,蛋白印跡法檢測(cè)胞漿和胞核炎癥通路蛋白NF-κB、p-NF-κB和細(xì)胞內(nèi)ERK1/2、p38MAPK、JNK、Akt及其磷酸化水平。為研究DHA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞NF-κB活化的影響,不同濃度DHA預(yù)孵育HT-29細(xì)胞24 h后,50ng/ml TNF-α處理HT-29細(xì)胞1 h,qRT-PCR檢測(cè)IL-8 mRNA,蛋白印跡法檢測(cè)IL-1β和ERK1/2、p38MAPK、JNK、Akt及其磷酸化蛋白,以及胞漿和胞核中NF-κB、p-NF-κB水平。結(jié)果:(1)WT+HFD組小鼠結(jié)腸腫瘤負(fù)荷高于WT+NFD組,而fat-1+HFD組則低于WT+HFD。根據(jù)氣相色譜結(jié)果,野生型小鼠結(jié)腸組織n-6/n-3 PUFAs比值明顯高于fat-1小鼠。qRT-PCR分析表明,WT+HFD組結(jié)腸組織炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β明顯高于WT+NFD和fat-1+HFD組。蛋白印跡結(jié)果顯示,WT+HFD組pGSK3β、β-catenin、NF-κB、p-NF-κB、p-STAT3、NLRP3等炎癥通路蛋白表達(dá)明顯高于WT+NFD小鼠和fat-1+HFD小鼠。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),WT+HFD組小鼠PCNA表達(dá)高于WT+NFD組和fat-1+HFD組。蛋白印跡分析顯示,WT+HFD組結(jié)腸組織凋亡相關(guān)蛋白caspase 3活性形式cleaved caspase 3水平明顯低于WT+NFD和fat-1+HFD組。qRT-PCR結(jié)果表明,WT+HFD小鼠癌基因c-myc mRNA水平明顯高于WT+NFD小鼠和fat-1+HFD小鼠。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DHA降低巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA水平,抑制M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物TNF-α、IL-1β、IL-6、CCR7 mRNA表達(dá),增強(qiáng)M2型標(biāo)記物CCL4 mRNA表達(dá)。(3)DHA抑制TNF-α處理的結(jié)腸HT-29細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-8表達(dá)及其ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt表達(dá),抑制NF-κB的活化。結(jié)論:(1)高脂肪飲食上調(diào)TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3、GSK3β/β-catenin/c-myc炎癥信號(hào)通路、促進(jìn)NLRP3炎癥小體的形成、增加AOM誘導(dǎo)的小鼠腸腫瘤發(fā)生。(2)n-3 PUFAs降低小鼠腸組織TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3炎癥通路相關(guān)蛋白表達(dá)、抑制NLRP3表達(dá)、拮抗高脂肪飲食小鼠結(jié)腸腫瘤形成。(3)n-3 PUFAs(DHA)抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型向M2型轉(zhuǎn)變。(4)n-3 PUFAs(DHA)下調(diào)Akt和MAPK信號(hào)通路、抑制TNF-α刺激HT-29細(xì)胞NF-κB的活化。綜上,n-3 PUFAs可抑制高脂肪飲食小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生,該作用與抑制炎癥信號(hào)通路、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型向M2轉(zhuǎn)變有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R151

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2288573