【摘要】：背景：氧化石墨烯(GO)是由單層碳原子組成的六角形結(jié)構(gòu),由于其獨(dú)特的光、電等特性,使其在生物醫(yī)藥、電子元件,復(fù)合材料等領(lǐng)域嶄露頭角,被認(rèn)為是生物傳感器、藥物載體及生物成像等眾多研究與應(yīng)用領(lǐng)域極具潛能的工程納米材料。GO在給人類帶來巨大經(jīng)濟(jì)利益和技術(shù)突破的同時,也對環(huán)境和人類的健康與安全產(chǎn)生了潛在威脅。秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)是一種在發(fā)育、遺傳等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的模式動物,具有繁殖周期短、周身透明、成本低廉、遺傳背景清楚等眾多優(yōu)良特性,近年來已被成功用于環(huán)境毒理、納米毒理等研究領(lǐng)域。本研究擬利用秀麗線蟲在體模型在毒理學(xué)研究領(lǐng)域的優(yōu)勢,系統(tǒng)解析GO的致毒效應(yīng)及可能分子機(jī)制,結(jié)合化學(xué)改造的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)(N-GQDs)與植物生物活性分子的特性解析其對GO毒性的可能預(yù)防保護(hù)作用,以期為GO在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：利用秀麗線蟲在體評價模型的優(yōu)勢,選擇壽命、運(yùn)動行為、后代數(shù)目、腸道ROS誘導(dǎo)、生殖細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)作為評價終點(diǎn),系統(tǒng)解析GO致毒效應(yīng)的分子機(jī)理。通過Rho B熒光探針標(biāo)記G0分析G0在秀麗線蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)與分布。分別利用SOLiD和Illumina HiSeqTM 2000測序技術(shù)分析G0暴露對秀麗線蟲miRNAs和mRNAs表達(dá)譜的影響,通過生物信息學(xué)、分子生物學(xué)與遺傳學(xué)等手段分析miRNAs和mRNAs在G0毒性調(diào)控中的生物學(xué)功能。利用改造后的氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)(N-GQDs)、甘草及其生物活性成分探索化學(xué)改造與植物生物活性分子對G0毒性的可能預(yù)防保護(hù)作用。結(jié)果：1、miRNAs對G0致秀麗線蟲在體毒效應(yīng)的調(diào)控作用：通過SOLiD測序,在GO暴露秀麗線蟲中確定了23個上調(diào)和8個下調(diào)的miRNAs。通過KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫和基因本體論分析發(fā)現(xiàn),這些miRNAs分子可能參與控制多種生物學(xué)過程。應(yīng)用miRNAs突變體,基于壽命及衰老相關(guān)表型評價終點(diǎn)的分析,對候選miRNAs分子在G0毒效應(yīng)中的調(diào)控功能進(jìn)行驗(yàn)證。其中,mir-244和mir-235突變體對G0毒效應(yīng)表現(xiàn)得比野生型更加敏感,mir-247/797, mir-73/74和mir-231突變體則表現(xiàn)出對G0毒效應(yīng)的抗性。在秀麗線蟲中,miRNAs分子可能通過影響胰島素/胰島素樣生長因子信號通路、TOR信號通路和germline信號通路功能從而調(diào)控G0縮減壽命的生物效應(yīng)。2、miRNAs-mRNAs分子網(wǎng)絡(luò)在G0致秀麗線蟲毒效應(yīng)中的調(diào)控作用：利用Illumina HiSeqTM 2000測序技術(shù)從G0暴露秀麗線蟲中分別鑒定了970個上調(diào)和995個下調(diào)的mRNAs。鑒于miRNAs可以通過與靶基因結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能,基于所獲取的差異表達(dá)miRNAs和mRNAs,確立了G0毒效應(yīng)中的miRNAs-mRNAs分子網(wǎng)絡(luò)。所確立的miRNAs-mRNAs分子網(wǎng)絡(luò)有助于解釋氧化應(yīng)激、腸道發(fā)育與功能和排泄行為在G0毒效應(yīng)調(diào)控中的重要生物學(xué)功能。在此miRNAs-mRNAs分子網(wǎng)絡(luò)中,系列miRNAs可能以JNK信號通路編碼基因?yàn)榘悬c(diǎn)調(diào)控G0毒效應(yīng)。在JNK信號通路中,JKK-1和MEK-1作為JNK-1的上游調(diào)控分子調(diào)控G0毒效應(yīng)。3、GO致秀麗線蟲次級靶器官生殖細(xì)胞毒性及分子機(jī)制：G0暴露可以誘導(dǎo)秀麗線蟲生殖細(xì)胞的凋亡。此過程需要核心凋亡分子ced-3和ced-4基因的參與。DNA損傷應(yīng)答在G0所誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡中必不可少。G0暴露可以誘導(dǎo)秀麗線蟲中生殖腺分裂細(xì)胞中DNA產(chǎn)生損傷,從而阻滯細(xì)胞周期。通過miRNAs靶點(diǎn)預(yù)測找到了一些可能與G0誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNAs分子。其中,mir-360突變后生殖細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用明顯高于野生型。因此,miRNAs在G0所誘導(dǎo)的秀麗線蟲生殖細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要功能,這種功能可能是通過核心凋亡信號通路和細(xì)胞周期節(jié)點(diǎn)蛋白來發(fā)揮的。4、p38信號通路調(diào)控G0致秀麗線蟲毒效應(yīng)及其分子機(jī)制：G0暴露可以改變p38信號通路編碼基因的表達(dá)模式,并導(dǎo)致其中PMK-1蛋白表達(dá)從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。sek-1、mek-1和pmk-1突變體呈現(xiàn)出對G0敏感的表型,且sek-1、 mek-1和pmk-1基因突變導(dǎo)致更多G0在動物體內(nèi)的積累。腸道pmk-1特異性RNAi干擾與全身RNAi對GO的敏感性相似,腸道特異性表達(dá)pmk-1可以恢復(fù)pmk-1突變體的敏感表型。在G0暴露條件下,pmk-1;mek-1或pmk-1;sek-1雙突變體呈現(xiàn)出與pmk-1單突變體類似的表型,暗示mek-1或sek-1作用于pmmk-1上游調(diào)控G0毒性。在G0暴露條件下,pmk-1;skn-1雙突變體呈現(xiàn)出與skn-1單突變體類似的表型; pmk-1 gst-4呈現(xiàn)出與gst-4單突變體類似的表型,skn-1 gst-4雙突變對G0的敏感性與gst-4類似,暗示SKN-1或GST-4在PMK-1下游調(diào)控G0毒性,且SKN-1作用于GST-4上游調(diào)控G0毒性。5、氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)的安全性評價及其細(xì)胞學(xué)機(jī)制：采用延長暴露方式對野生型及sod-2和sod-3敏感突變體進(jìn)行暴露(sod-2和sod-3基因編碼Ms-SODs)。壽命、致死率、生殖和運(yùn)動行為等評價終點(diǎn)分析顯示,氮摻雜石墨烯量子點(diǎn)(N-GQDs)對秀麗線蟲初次級靶器官的功能并沒有產(chǎn)生不良影響,且沒有致死效應(yīng)。此外,在野生型和突變體的后代分析中也沒有檢測到N-GQDs毒性效應(yīng)。對野生型和突變體秀麗線蟲的分析發(fā)現(xiàn),N-GQDs只分布秀麗線蟲的腸道,受精卵及子代中沒有檢測到N-GQDs的積累。N-GQDs暴露后,野生型與突變體秀麗線蟲腸道屏障和排泄行為保持正常。基于所獲數(shù)據(jù),提出腸道生物屏障與排泄行為生理狀態(tài)以及相對于GO降低的C=O=C基團(tuán)是導(dǎo)致N-GQDs難以在動物體內(nèi)積累的重要原因。6、甘草活性成分甘草酸預(yù)防G0致秀麗線蟲毒效應(yīng)及分子機(jī)制：甘草(GR)預(yù)處理(62.5-125 mg/mL)可以拮抗G0對秀麗線蟲初級和次級靶器官的毒效應(yīng)。在甘草的化學(xué)成分(甘草酸、甘草苷和異甘草苷)中,甘草酸是甘草拮抗G0毒效應(yīng)的主要活性成分。甘草酸預(yù)處理可以抑制G0穿過腸道屏障向次級靶器官轉(zhuǎn)運(yùn)。甘草酸預(yù)處理可以抑制腸道ROS的誘導(dǎo)、恢復(fù)G0誘導(dǎo)失調(diào)的氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)模式。甘草酸預(yù)處理還可以恢復(fù)G0誘導(dǎo)失調(diào)的miRNAs表達(dá)模式,且氧化應(yīng)激相關(guān)基因可以作為這些miRNAs分子的潛在靶基因。mir-360突變可以顯著增強(qiáng)甘草酸在拮抗GO毒效應(yīng)中的有益作用。因此,甘草酸可能通過影響氧化應(yīng)激相關(guān)基因及其上游miRNAs分子功能從而抑制G0在秀麗線蟲體內(nèi)的毒性與積累。結(jié)論：獲得了GO誘導(dǎo)異常表達(dá)的miRNAs和lnRNAs譜,并進(jìn)而提出了可能參與G0毒效應(yīng)調(diào)控的miRNAs-mRNAs分子網(wǎng)絡(luò)。對于G0毒效應(yīng)調(diào)控具體的分子機(jī)制,結(jié)果表明凋亡信號通路和細(xì)胞周期節(jié)點(diǎn)蛋白可能參與了GO生殖毒效應(yīng)的調(diào)控,p38信號通路(SEK-1/MEK-1-PMK-1-SKN-1-GST-4)在GO毒性及轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控中發(fā)揮重要功能。而且,提供證據(jù)證明了化學(xué)改造或藥物干預(yù)在預(yù)防G0毒效應(yīng)中的重要價值。
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【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114
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本文編號：2258420