【摘要】：新型環(huán)境持久性有機(jī)污染物全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS），性質(zhì)穩(wěn)定蓄積性強(qiáng)，由PFOS污染帶來(lái)的健康危害已越來(lái)越引起人們關(guān)注。PFOS不但可誘導(dǎo)肝臟、神經(jīng)、免疫及內(nèi)分泌系統(tǒng)的損害，而且對(duì)動(dòng)物的生殖發(fā)育也有影響。近年來(lái)在PFOS生殖毒性研究中，主要關(guān)注了PFOS對(duì)雄性的內(nèi)分泌干擾作用，以及經(jīng)此途徑誘導(dǎo)雄性生殖損傷相關(guān)分子機(jī)制。然而，對(duì)于PFOS是否能夠通過(guò)血—睪屏障進(jìn)入睪丸及是否能夠發(fā)揮直接破壞作用尚未見報(bào)道。血—睪屏障是廣泛存在于哺乳動(dòng)物睪丸中的一種特殊的“血—組織”屏障結(jié)構(gòu)，對(duì)維持正常的精子發(fā)生具有重要意義。近年來(lái)，血—睪屏障在外源性化學(xué)物誘導(dǎo)的雄性生殖損害過(guò)程中的作用越來(lái)越引起關(guān)注。PFOS若存在睪丸的直接損傷，，需通過(guò)血—睪屏障進(jìn)入睪丸實(shí)質(zhì)，闡明PFOS影響血—睪屏障及其分子機(jī)制有助于全面認(rèn)識(shí)PFOS誘導(dǎo)的雄性生殖損傷過(guò)程。 本研究緊緊圍繞上述問(wèn)題，建立整體及體外PFOS染毒模型，評(píng)估血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能的變化，分析血—睪屏障相關(guān)連接蛋白表達(dá)及定位改變，尋找睪丸內(nèi)PFOS毒作用關(guān)鍵的靶細(xì)胞和靶分子，明確關(guān)鍵信號(hào)通路在PFOS調(diào)控血—睪屏障中的作用，從而深入探討PFOS對(duì)血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能影響的分子機(jī)制。為化學(xué)物的生殖毒理學(xué)研究提供提供有益的補(bǔ)充和技術(shù)支撐，也為環(huán)境持久性有機(jī)污染物的生殖風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、危害控制及預(yù)防提供重要參考。 第一部分：PFOS致雄性小鼠生殖毒效應(yīng)的研究 目的：建立PFOS雄性生殖損傷模型，明確PFOS對(duì)睪丸的直接損傷作用，尋找關(guān)鍵的靶細(xì)胞。方法：一定劑量的PFOS給予ICR小鼠經(jīng)口灌胃染毒，通過(guò)體重及臟器系數(shù)觀察一般毒性；運(yùn)用放免法檢測(cè)血清生殖相關(guān)激素觀察PFOS內(nèi)分泌干擾效應(yīng)；運(yùn)用光鏡及電鏡在形態(tài)上觀察睪丸生精上皮的破壞，尋找關(guān)鍵的靶細(xì)胞。采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（Computer-assisted sperm analysis，CASA）觀察精子相關(guān)參數(shù)，確認(rèn)PFOS對(duì)精子發(fā)生的影響。結(jié)果：1.一般毒性：在0~50mg/kg/d劑量下，PFOS未對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生顯著影響，睪丸和附睪的臟器系數(shù)也未出現(xiàn)顯著改變。2.血清生殖激素：與對(duì)照組相比，PFOS可顯著誘導(dǎo)動(dòng)物血清睪酮（Testosterone，T）水平降低，而其它如雌激素（Estradiol，E2）、促卵泡生成素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（Luteinizinghormone，LH）變化則不顯著。3.睪丸形態(tài)學(xué)：光鏡下，PFOS可顯著誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞空泡化，在高劑量組生精小管腔可見自生精上皮剝脫的未成熟生精細(xì)胞。電鏡下，與對(duì)照組相比，2.5、25和50mg/kg/d劑量組睪丸出現(xiàn)顯著的支持細(xì)胞空泡化改變，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多脂滴。4.精子參數(shù)：PFOS可顯著降低動(dòng)物精子計(jì)數(shù)，并呈劑量依賴關(guān)系，尤其在2.5、25和50mg/kg/d劑量組（0.25和2.5mg/kg/d劑量組，p0.05；25和50mg/kg/d劑量組，p0.01）。50mg/kg/d劑量的PFOS可顯著降低精子活動(dòng)率（p0.05），25和50mg/kg/d劑量的PFOS可顯著降低快速細(xì)胞百分率（25mg/kg/d劑量組，p0.05；50mg/kg/d劑量組，p0.01）。 第二部分：PFOS對(duì)小鼠血—睪屏障結(jié)構(gòu)及功能的影響 目的：探討PFOS對(duì)血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能的影響，在整體水平分析相關(guān)的分子機(jī)制。方法：利用已建立的PFOS染毒小鼠模型，采用電鏡觀察PFOS對(duì)血—睪屏障結(jié)構(gòu)的破壞；利用生物素示蹤劑觀察PFOS對(duì)血—睪屏障功能的影響；運(yùn)用UPLC/MS/MS檢測(cè)血清及睪丸中的PFOS暴露，分析PFOS通過(guò)血—睪屏障的能力；采用免疫印跡和免疫組化檢測(cè)睪丸組織血—睪屏障相關(guān)連接蛋白的表達(dá)和定位，探討關(guān)鍵的靶分子和相關(guān)分子機(jī)制。結(jié)果：1.血—睪屏障超微結(jié)構(gòu)：與對(duì)照組相比，2.5到50mg/kg/d劑量組血—睪屏障超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的肌動(dòng)蛋白束缺失，緊密連接解體和囊泡。2.血—睪屏障功能：與對(duì)照組相比，2.5到50mg/kg/d劑量組的睪丸組織可見生物素示蹤劑跨過(guò)血—睪屏障進(jìn)入生精小管的頂端室。3. PFOS通過(guò)血—睪屏障的能力：與對(duì)照組相比，在各PFOS處理組的血清和睪丸樣品中均可檢測(cè)出PFOS。血清PFOS水平與睪丸PFOS含量呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.9676，Pearson，p0.0001）4.血—睪屏障連接相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位：PFOS可下調(diào)睪丸緊密連接相關(guān)蛋白（Tight junction，TJ）：ZO-1(2.5，25和50mg/kg/d劑量組，p0.01)、 Claudin-11和Occludin (2.5mg/kg/d劑量組， p0.05；25和50mg/kg/d劑量組，p0.01)的表達(dá)。同樣縫隙連接相關(guān)蛋白（Gap junction，GJ）：Connexin-43(25和50mg/kg/d劑量組，p0.05)和p-Connexin-43(2.5，25和50mg/kg/d劑量組，p0.05)表達(dá)也下調(diào)，并呈劑量依賴關(guān)系。此外，2.5到50mg/kg/d劑量的PFOS還可顯著降低ZO-1、Claudin-11、Occludin和Connexin-43血—睪屏障處的定位。5.絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路的激活：磷酸化的Erk和p-38表達(dá)顯著增加(p-Erk，25和50mg/kg/d劑量組，p0.01；p-p38，2.5mg/kg/d劑量組，p0.05，25和50mg/kg/d劑量組，p0.01)。 第三部分：PFOS靶向Sertoli細(xì)胞影響血—睪屏障功能的機(jī)制研究 目的：探討支持細(xì)胞在PFOS誘導(dǎo)的血—睪屏障破壞過(guò)程中的作用，分析血—睪屏障連接相關(guān)蛋白表達(dá)和定位改變與MAPK信號(hào)通路激活的關(guān)系。方法：采用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)篩選對(duì)PFOS敏感細(xì)胞株，驗(yàn)證整體水平的結(jié)果；運(yùn)用RT-PCR的方法鑒定支持細(xì)胞株上PFOS相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，驗(yàn)證PFOS靶向支持細(xì)胞作用可能的途徑。采用免疫印跡和免疫熒光分析血—睪屏障相關(guān)連接蛋白的表達(dá)和定位，驗(yàn)證整體水平的結(jié)果，并探討相關(guān)的分子機(jī)制。運(yùn)用MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑聯(lián)合PFOS共同處理支持細(xì)胞，采用免疫印跡法及免疫熒光分析關(guān)鍵連接蛋白表達(dá)的變化，確認(rèn)MAPK信號(hào)通路與支持細(xì)胞上血—睪屏障連接相關(guān)蛋白表達(dá)和定位改變的關(guān)系。采用原代支持細(xì)胞對(duì)部分重要結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：1.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：相對(duì)其它睪丸細(xì)胞株，支持細(xì)胞株（TM4）對(duì)PFOS毒作用相對(duì)敏感。2. PFOS相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的鑒定：支持細(xì)胞株上表達(dá)有OAT1、OATP1和OATP3。3.支持細(xì)胞血—睪屏障相關(guān)連接蛋白的表達(dá)及定位：PFOS可顯著誘導(dǎo)連接蛋白Claudin-11、ZO-1、Occludin、Connexin-43和p-Connexin-43表達(dá)下調(diào)（p0.05或p0.01）。Claudin-11和Connexin-43的細(xì)胞定位：隨著劑量增加，細(xì)胞漿Claudin-11表達(dá)顯著下降，尤其在高劑量組（100和150μM）。Connexin-43主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，隨著PFOS劑量增加，表達(dá)也呈下降趨勢(shì)。4. MAPK特異性抑制劑與PFOS聯(lián)合處理后血—睪屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位：JNK和Erk MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑不能逆轉(zhuǎn)PFOS誘導(dǎo)的連接蛋白下調(diào)。與之相反，p-38MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑可顯著抑制PFOS誘導(dǎo)的連接蛋白表達(dá)下調(diào)及細(xì)胞膜定位減少。5.原代支持細(xì)胞驗(yàn)證：PFOS可誘導(dǎo)原代支持細(xì)胞屏障功能下降及TJ蛋白（ZO-1、Claudin-11和Occludin）和GJ蛋白（Connexin-43和p-Connexin-43）表達(dá)的下調(diào)（20和30μM，p0.05或p0.01）；p-38MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑SB203580可顯著抑制PFOS誘導(dǎo)原代支持細(xì)胞屏障功能的下降及連接蛋白表達(dá)的下調(diào)。 結(jié)論 1. PFOS可誘導(dǎo)雄性ICR小鼠生殖損傷，支持細(xì)胞很可能是PFOS的重要作用靶點(diǎn)。 2. PFOS可破壞血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能，使得PFOS能進(jìn)入生精上皮，從而發(fā)揮直接的生殖毒作用。血—睪屏障連接相關(guān)蛋白ZO-1、Claudin-11、Occludin、Connexin-43和p-Connexin-43很可能是PFOS毒作用的靶分子，與PFOS誘導(dǎo)的血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能破壞有關(guān)。 3. PFOS可能通過(guò)靶向支持細(xì)胞，激活p38MAPK信號(hào)通路，下調(diào)血—睪屏障連接相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞定位，從而誘導(dǎo)血—睪屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞。該機(jī)制在PFOS誘導(dǎo)的雄性生殖損傷中可能起關(guān)鍵作用。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：2255537