發(fā)布時(shí)間：2018-05-13 19:50

  本文選題：納米氧化鋅 + 呼吸道炎癥��； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景及目的納米氧化鋅(Zinc oxide nanoparticles,ZnO-NPs)是一種粒徑在1~100 nm的金屬氧化物,具有納米材料的宏觀量子隧道效應(yīng)、體積效應(yīng)、表面效應(yīng)等特性,可用于水泥、輪胎、顏料、紡織品、食品藥品、油漆、潤(rùn)滑劑等工業(yè)生產(chǎn)中。隨著納米氧化鋅的廣泛應(yīng)用,職業(yè)人群的暴露幾率也大大增加。研究表明,納米氧化鋅能夠通過呼吸道進(jìn)入人體,沉積于支氣管及肺泡中,引起炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子釋放,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),誘發(fā)呼吸道炎癥,但具體機(jī)制尚不清楚。外泌體(exosomes)是由細(xì)胞分泌的膜性囊泡,含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸物質(zhì),參與細(xì)胞通訊、免疫調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激、炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究顯示,外泌體主要是通過將攜帶的miRNAs傳遞給受體細(xì)胞,調(diào)控受體細(xì)胞靶基因的表達(dá),改變細(xì)胞因子及炎癥因子的表達(dá)水平,促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展。那么納米氧化鋅是否會(huì)改變外泌體中的miRNAs呢?目前尚未有相關(guān)研究,有待進(jìn)一步的探究證實(shí)。為探究納米氧化鋅所致的呼吸道炎癥中外泌體miRNAs的表達(dá),本實(shí)驗(yàn)通過超速離心法和試劑盒法分離血清外泌體,利用高通量基因芯片檢測(cè)技術(shù),篩選差異miRNAs,以期找到與納米氧化鋅所致呼吸道炎癥密切相關(guān)的miRNAs。方法1.納米氧化鋅致呼吸道炎癥:將SD大鼠隨機(jī)分為4組:低(2 mg/ml)、中(4 mg/ml)、高(8 mg/ml)劑量納米氧化鋅染毒組和生理鹽水對(duì)照組,采用氣管滴注法連續(xù)染毒3 d,每天染毒1次,染毒結(jié)束后24 h,麻醉大鼠后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,檢測(cè)血液白細(xì)胞分類,ELISA法測(cè)定各組血清IL-8、IL-1β、TNF-α;收集肺泡灌洗液,檢測(cè)BALF中總蛋白及乳酸脫氫酶(LDH)活性;通過肺組織HE染色觀察病理改變。2.外泌體的提取與鑒定:采用超高速離心法和試劑盒法提取血清外泌體,通過透射電鏡觀察外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu),Western blot方法對(duì)外泌體特征性蛋白CD63、Alix進(jìn)行鑒定。3.外泌體差異miRNAs的生物學(xué)信息檢測(cè)及分析:用外泌體RNA提取試劑盒提取外泌體總RNA,通過去磷酸化、樣品變性、連接標(biāo)記、樣品純化,使用Agilent芯片雜交,芯片洗滌、掃描后對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,篩選差異miRNAs。結(jié)果1.納米氧化鋅誘發(fā)大鼠呼吸道炎癥:(1)染毒后大鼠的基本情況:染毒結(jié)束后,納米氧化鋅染毒組大鼠出現(xiàn)精神萎靡,攝食量減少;染毒前后,生理鹽水組大鼠體重增加,而各染毒組體重均減輕。(2)肺泡灌洗液中總蛋白及乳酸脫氫酶活性:與生理鹽水對(duì)照組相比,低、中、高劑量染毒組乳酸脫氫酶活性、總蛋白含量均升高,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)納米氧化鋅對(duì)大鼠外周血細(xì)胞分類的影響:與生理鹽水對(duì)照組相比,低、中、高劑量納米氧化鋅染毒組的外周血中白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞百分比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)大鼠血清細(xì)胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α的變化:低、中、高劑量納米氧化鋅染毒組大鼠血清中IL-8、IL-1β、TNF-α水平均高于生理鹽水對(duì)照組(P0.05)。(5)肺組織病理學(xué)改變:生理鹽水組肺泡結(jié)構(gòu)清晰,少有結(jié)構(gòu)破壞;低劑量組伴輕微炎細(xì)胞浸潤(rùn)和少量滲出物形成;中劑量組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和滲出物明顯增多,肺實(shí)變面積增加;高劑量組肺泡壁充血水腫,肺組織完全實(shí)變。2.大鼠血清來源外泌體的提取與鑒定:超高速離心法和試劑盒法均能提取到血清外泌體,通過透射電鏡觀察到外泌體大小均勻,呈橢圓形或圓形,并表達(dá)外泌體特征性蛋白CD63和Alix。3.外泌體miRNAs芯片分析:miRNA芯片共篩選出23種差異表達(dá)的miRNAs,其中16種表達(dá)上調(diào),7種表達(dá)下調(diào),其中miR-134-5p、miR-290、miR-130a-3p、miR-19a-3p、miR-223-3p在炎癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。結(jié)論1.納米氧化鋅誘發(fā)了大鼠呼吸道炎癥,并改變其血清外泌體miRNA的表達(dá)。2.納米氧化鋅誘發(fā)的呼吸道炎癥中,外泌體可能通過miR-223-3p、miR-134-3p、miR-130a-3p、miR-30b-5p調(diào)控炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:Background and purpose Zinc oxide nanoparticles (ZnO-NPs) is a metal oxide with a particle size of 1~100 nm, with the macroscopic quantum tunneling effect, volume effect, surface effect and other properties of nanomaterials, which can be used in the industrial production of cement, tires, pigments, textiles, food drugs, paints, lubricants and so on. With nanoscale Zinc Oxide The study shows that nano Zinc Oxide can enter the human body through the respiratory tract, deposit in the bronchi and alveoli through the respiratory tract, cause the release of inflammatory mediators and cytokines, inflammatory cells infiltrating, and induced respiratory inflammation, but the body mechanism is not clear. The exocrine (exosomes) is secreted by the secretory cells. Membranous vesicles, rich in protein, nucleic acid substances, involved in cell communication, immunomodulation, oxidative stress, inflammation and tumor development. Studies show that exocrine mainly transfers the miRNAs to receptor cells, regulates the expression of receptor cell target genes, changes the expression level of cytokines and inflammatory factors, and promotes the expression of cytokines and inflammatory factors. The occurrence and development of inflammation. Will nano Zinc Oxide change the miRNAs in the exocrine? There is no relevant research yet to be further explored. To explore the expression of miRNAs in the respiratory tract of the respiratory tract caused by nanoscale Zinc Oxide, this experiment uses high pass centrifugation and kit method to separate the serum exosbodies and use high pass. Quantitative gene chip detection technique was used to screen differential miRNAs, in order to find the respiratory inflammation caused by miRNAs. method 1. nanoscale Zinc Oxide, which is closely related to respiratory inflammation caused by nano Zinc Oxide. The SD rats were randomly divided into 4 groups: low (2 mg/ml), medium (4 mg/ml), high (8 mg/ml) dose nanoscale Zinc Oxide dye group and saline control group, using trachea drop 3 D were continuously poisoned, 1 times a day and 24 h after the end of the poison. After the anesthesia rats were collected through the abdominal aorta, the blood leucocyte classification was detected. The serum IL-8, IL-1 beta, TNF- alpha were measured by ELISA method, and the pulmonary alveolar lavage fluid was collected to detect the activity of total protein and lactate dehydrogenase (LDH) in BALF, and the HE staining of lung tissue was used to observe the pathological changes of.2. exudate by HE staining in the lung tissue. Extraction and identification: ultra high speed centrifugation and kit method were used to extract serum exocrine. The morphological structure of exocrine was observed by transmission electron microscope. Western blot method was used to detect and analyze the biological information of.3. exocrine differential miRNAs, Alix was used to detect and analyze the biological information of.3. exocrine differential miRNAs. External secretory RNA extraction kit was used to extract the total RNA of external secretory. Through dephosphorylation, sample denaturation, connection markers, sample purification, Agilent chip hybridization, chip washing, and scanning, the results were standardized, and the results of differential miRNAs. were screened by 1. nano Zinc Oxide to induce respiratory inflammation in rats: (1) the basic situation of rats after poisoning: after the poisoning was finished, the spirit of nanoscale Zinc Oxide exposed rats appeared spirit The total protein and lactate dehydrogenase activity in the alveolar lavage solution: compared with the normal saline control group, the activity of lactate dehydrogenase and the total protein content in the low, middle and high dose groups were increased, and the dose dependent effect was found in the low, middle and high dose groups. The difference was statistically significant (P0.05). (3) the effect of nano Zinc Oxide on the classification of peripheral blood cells in rats: compared with the normal saline control group, the total number of white blood cells in the peripheral blood, the number of lymphocytes, the percentage of neutrophils and neutrophils in the low, middle and high dose group of nanoscale Zinc Oxide were statistically significant (4). Changes in serum cytokine IL-8, IL-1 beta, TNF- alpha in rat serum: low, medium, high dose nano Zinc Oxide infected rats serum IL-8, IL-1 beta, TNF- alpha levels were higher than the normal saline control group (P0.05). (5) pathological changes in lung tissue: the alveolar structure of the saline group was clear, less structural damage, low dose group with mild inflammatory cell infiltration and a small amount of exudation. The infiltration and exudation of inflammatory cells in the middle dose group increased significantly and the area of pulmonary consolidation increased; the alveolar wall congestion and edema in the high dose group, the extraction and identification of the serum sources of the.2. rats in the lung tissue completely changed: the ultra high speed centrifugation and the kit method could extract the serum exocrine, and the size of the exosecrete was observed through transmission electron microscope. Homogeneous, oval or circular, and expression of exosecrete characteristic protein CD63 and Alix.3. exosecrete miRNAs chip analysis: miRNA chip has screened 23 differentially expressed miRNAs, 16 of which are up regulated and 7 down regulated, of which miR-134-5p, miR-290, miR-130a-3p, miR-19a-3p, miR-223-3p play an important role in the development of inflammation. On 1. nanoscale Zinc Oxide induced respiratory inflammation in rats and changing the expression of its serum exosomatic miRNA expression of.2. nanoscale Zinc Oxide induced respiratory inflammation, exosbodies may regulate the inflammatory response through miR-223-3p, miR-134-3p, miR-130a-3p, and miR-30b-5p.

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R114

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本文編號(hào)：1884560