本文選題：Cr(Ⅵ)/六價鉻 + 人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE細(xì)胞)�。� 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：1研究背景 鞣革、印染、電子、煉礦等工業(yè)行業(yè)廣泛應(yīng)用鉻的化合物,這些化合物中及生產(chǎn)后形成的六價鉻[Cr(Ⅵ)]以“三廢”形式大量排放至自然環(huán)境。Cr(Ⅵ)化合物是人體極毒物,具有生殖、遺傳等多器官、多方面的毒性,被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)定為人類確定致癌物。 聚-ADP-核糖基化是分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點之一。此反應(yīng)是在聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的催化下,使聚腺苷二磷酸核糖多聚體(PAR)共價連接到受體蛋白上去的過程。聚-ADP-核糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾方式之一,與細(xì)胞的發(fā)育、分化、凋亡及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展等很多重要的生命活動相關(guān)。聚-ADP-核糖-蛋白水解酶(PARG)可清除PAR線狀和分枝的核糖與核糖基,主要負(fù)責(zé)水解蛋白受體上大部分ADP-核糖單元。PARP與PARG的活性平衡維持著細(xì)胞內(nèi)聚-ADP-核糖基化的水平,從而保持受體蛋白活性的穩(wěn)定。 盡管目前國內(nèi)外對Cr(Ⅵ)的致癌性和聚-ADP-核糖基化的生物效應(yīng)的研究很多,但尚未見有聚-ADP-核糖基化與Cr(Ⅵ)毒性關(guān)系的報道,本研究從分子水平探討聚-ADP-核糖基化在Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷過程中的生物效應(yīng),揭示兩者可能的關(guān)系,為研究Cr(Ⅵ)的細(xì)胞損傷提供新的思路。 2研究方法 2.1Cr(Ⅵ)對16HBE的損害及聚-ADP-核糖基化在其中的影響分析 以正常的人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)及實驗室前期構(gòu)建的PARG基因缺陷的16HBE細(xì)胞株(以后簡稱PARG缺陷細(xì)胞)為研究對象,使用梯度濃度Cr(Ⅵ)染毒,CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制能力,免疫熒光技術(shù)分析PAR表達(dá),流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期,ELISA三明治方法和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA損傷,RT-PCR及Western Blotting分析ATM、P53、K-ras基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。 2.2Cr(Ⅵ)作用下16HBE細(xì)胞基因組DNA甲基化水平的改變及聚-ADP-核糖基化在其中的影響 Cr(Ⅵ)作用后,免疫熒光技術(shù)檢測16HBE細(xì)胞及PARG缺陷細(xì)胞的基因組DNA整體甲基化水平,RT-PCR及Western Blotting分析DNA甲基化相關(guān)蛋白酶DNMT1, DNMT3a、DNMT3b、MBD2基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。 2.3Cr(Ⅵ)作用下16HBE細(xì)胞中PARG功能相關(guān)蛋白的篩選及其功能的初步探討 聯(lián)合應(yīng)用2D-DIGE和MALDI-TOF-MS/MS技術(shù)識別和鑒定Cr(Ⅵ)染毒后16HBE細(xì)胞和PARG細(xì)胞的差異蛋白,UniProt搜庫獲得各差異蛋白功能,對差異蛋白和聚-ADP-核糖基化反應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行簡單探討。 3研究結(jié)果 3.1Cr(Ⅵ)對16HBE的損害及聚-ADP-核糖基化在其中的影響分析 兩種細(xì)胞內(nèi)PAR的生成均與Cr(Ⅵ)存在劑量效應(yīng),PARG缺陷細(xì)胞內(nèi)PAR基礎(chǔ)水平明顯高于16HBE細(xì)胞且降解時間更長；兩種細(xì)胞的周期變化無異,都出現(xiàn)了S期阻滯；PARG缺陷細(xì)胞的凋亡明顯少于16HBE細(xì)胞的,DNA損傷受Cr(Ⅵ)的影響也明顯小于16HBE細(xì)胞,同染毒劑量下ATM.P53基因的表達(dá)顯著低于16HBE細(xì)胞；K-ras的表達(dá)無明顯變化。 3.2Cr(Ⅵ)作用下16HBE細(xì)胞基因組DNA甲基化水平的改變及聚-ADP-核糖基化在其中的影響 16HBE細(xì)胞的整體甲基化水平在Cr(Ⅵ)作用下降低,且有劑量依賴,而PARG缺陷細(xì)胞染毒后5-mC熒光強(qiáng)度改變不明顯；16HBE細(xì)胞幾個檢測基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)都出現(xiàn)了存在劑量效應(yīng)的明顯下降；PARG缺陷細(xì)胞的DNMT3b和MBD2基因的表達(dá)與對照相比無差異,DNMT1和DNMT3a的表達(dá)存在Cr(Ⅵ)劑量依賴的下降,但降低幅度均比16HBE小。 3.3Cr(Ⅵ)作用下16HBE細(xì)胞中PARG功能相關(guān)蛋白的篩選及其功能的初步探討 2D-DIGE識別出26個差異蛋白,MALDI-TOF-MS/MS鑒定出其中9個,分別為ATP synthase subunit d；pyruvate kinase；cofilin-1； stress-induced-phosphoprotein1；thyroid receptor interactor； thioredoxin-dependent peroxide reductase； aldolase A； histone H2A.2；40S ribosomal protein S19； endoplasmic reticulum resident protein29。UniProt搜庫發(fā)現(xiàn)其中ATP synthase subunit d:pyruvate kinase； Stress-induced-phosphoprotein1； aldase A四個蛋白均具有調(diào)節(jié)能量代謝的功能。 4結(jié)論 4.1Cr(Ⅵ)對16HBE細(xì)胞有明顯的損傷作用,而缺陷PARG基因能對抗此作用,減少DNA損傷,改善細(xì)胞存活。 4.2缺陷PARG基因能調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性,對抗Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)的廣泛基因組低甲基化,維持16HBE細(xì)胞的基因組整體甲基化水平。 4.3通過影響能量代謝途徑發(fā)揮保護(hù)作用可能是聚-ADP-核糖基化對抗Cr(Ⅵ)毒害作用的主要途徑之一。
[Abstract]:1 Study Background


Cr ( 鈪，

本文編號：1857800