發(fā)布時(shí)間：2018-04-27 22:30

  本文選題：毒性測試 + 替代方法��； 參考：《吉林大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景： 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，大量的化學(xué)物涌入人類的生產(chǎn)生活和周圍環(huán)境，由此產(chǎn)生危害人體健康的安全問題日益突出。對(duì)這些化學(xué)物進(jìn)行合理的毒性測試（Toxicity Tsting），是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)管理的基礎(chǔ)。毒性測試即可以以整體動(dòng)物為載體，也可以應(yīng)用體外的細(xì)胞器細(xì)胞組織和器官等載體開展。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)理論和方法在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用，對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)的毒性測試已經(jīng)發(fā)展到體內(nèi)試驗(yàn)與體外分子細(xì)胞水平相結(jié)合的毒性測試的新模式。2007年美國國家研究委員會(huì)（NCR）發(fā)布的《21世紀(jì)毒性測試：遠(yuǎn)景與策略》報(bào)告，進(jìn)一步促進(jìn)了毒性測試由傳統(tǒng)的基于整體動(dòng)物的體內(nèi)測試轉(zhuǎn)向基于人源細(xì)胞細(xì)胞器，整合機(jī)制研究的體外測試。雖然短期內(nèi)，以整體動(dòng)物為載體的傳統(tǒng)毒性測試將與以應(yīng)用體外的細(xì)胞器細(xì)胞組織和器官的毒性測試替代方法并存，但從長遠(yuǎn)來看，毒理學(xué)替代方法是毒性測試新的發(fā)展方向和趨勢。這不僅是動(dòng)物福利的需要，也是獲取高通量可靠毒性測試數(shù)據(jù)的需求。故本論文基于毒性測試的替代方法，分兩部分展開。第一部分應(yīng)用可減少動(dòng)物使用數(shù)量的清醒遙測動(dòng)物技術(shù)，研究清醒遙測小型豬在化學(xué)物質(zhì)心血管系統(tǒng)毒性測試中替代清醒遙測犬的可行性；第二部分以人源心肌細(xì)胞系為研究模型，研究已知的具有明顯心臟毒性的化合物阿霉素（Doxorubicin）對(duì)線粒體新生和PGC-1ɑ信號(hào)通路的影響，旨在找到化學(xué)物線粒體毒性的可能毒性通路并闡明化學(xué)物誘導(dǎo)線粒體毒性發(fā)生的作用機(jī)制，構(gòu)建化學(xué)物致線粒體毒性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵通路框架，為后續(xù)預(yù)測化學(xué)物導(dǎo)致線粒體毒性通路擾動(dòng)的閾劑量，以及結(jié)合PBPK模型預(yù)測化學(xué)物質(zhì)在人體內(nèi)的分布特征，綜合評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)對(duì)線粒體的毒性與安全性提供依據(jù)。 目的： 第一部分：清醒小型豬心血管遙測模型替代清醒比格犬模型在心血管安全藥理學(xué)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用 建立可在清醒狀態(tài)下長期動(dòng)態(tài)監(jiān)測小型豬和比格犬血壓心率心電圖和體溫的遙測模型，闡明小型豬模型替代比格犬模型在心血管安全藥理學(xué)評(píng)價(jià)中應(yīng)用的可行性，同時(shí)優(yōu)化心血管遙測實(shí)驗(yàn)步驟，達(dá)到減少動(dòng)物使用量提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量的目的。 第二部分：DOX致心肌細(xì)胞線粒體損傷的作用機(jī)制研究及線粒體毒性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵通路的識(shí)別 研究對(duì)線粒體新生和抗氧化相關(guān)的PGC-1ɑ信號(hào)通路在DOX引起的心肌細(xì)胞線粒體損傷中的關(guān)鍵調(diào)控作用。旨在找到化學(xué)物線粒體毒性的可能毒性通路并闡明化學(xué)物誘導(dǎo)線粒體毒性發(fā)生的作用機(jī)制，構(gòu)建化學(xué)物致線粒體毒評(píng)價(jià)的關(guān)鍵通路框架，為后續(xù)建立毒性通路劑量-反應(yīng)模型預(yù)測化學(xué)物導(dǎo)致線粒體毒性通路擾動(dòng)的閾劑量提供依據(jù)，為進(jìn)一步結(jié)合PBPK模型預(yù)測化合物在人體內(nèi)的分布特征，綜合評(píng)價(jià)化學(xué)物對(duì)線粒體的毒性與安全性做準(zhǔn)備。 方法： 第一部分清醒小型豬心血管遙測模型替代清醒比格犬模型在藥物心血管安全藥理學(xué)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用 1.清醒小型豬和清醒比格犬遙測模型的建立：在無菌手術(shù)室內(nèi)通過手術(shù)分別將可動(dòng)態(tài)監(jiān)測心電圖，血壓，心率和體溫的遙測傳感器（DSI，TL11M3-D70-PCT和TL11M3-D70-PCTP）植入8只比格犬（8.1-10.6kg）和8頭小型豬（15.6-18.5kg）體內(nèi)，恢復(fù)三周后根據(jù)動(dòng)物一般狀況體溫心電圖血壓和心率等信號(hào)是否正常來判定動(dòng)物模型是否建立成功。 2.模擬給藥喂食對(duì)清醒小型豬和比格犬心血管系統(tǒng)的影響：將遙測比格犬和小型豬隨機(jī)分成兩組，喂食組和非喂食組，每組每種動(dòng)物各四只。喂食組的實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)監(jiān)測4條比格犬和4頭小型豬的體溫心電圖血壓和心率信號(hào)2h作為基線數(shù)據(jù)后，分別給予4ml/kg的無菌水模擬灌胃，用來比較給藥動(dòng)作對(duì)兩種動(dòng)物心血管參數(shù)的影響；繼續(xù)監(jiān)測兩種動(dòng)物心血管參數(shù)6h后，進(jìn)行喂食，然后繼續(xù)監(jiān)測18小時(shí)，比較喂食對(duì)兩種動(dòng)物心血管參數(shù)的影響的差異；整個(gè)監(jiān)測過程包含12h/12h晝/夜循環(huán)，以比較兩種動(dòng)物心血管參數(shù)晝夜節(jié)律性的差異。非喂食組也包含4條比格犬和4頭小型豬，在監(jiān)測心血管各項(xiàng)參數(shù)過程中所有動(dòng)物不進(jìn)食，其余步驟同喂食組，以比較喂食與否對(duì)兩種動(dòng)物心血管參數(shù)晝夜節(jié)律性的影響。 第二部分DOX致心肌細(xì)胞線粒體損傷的作用機(jī)制研究及線粒體毒性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵通路的識(shí)別 1.DOX對(duì)AC16細(xì)胞線粒體新生的影響 DOX致細(xì)胞毒性和線粒體毒性量效關(guān)系檢測：DOX染毒分為對(duì)照組31.2562.51252505008001000和2000nM組，染毒時(shí)間為12h，染毒后分別用MTT法檢測細(xì)胞存活率激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位和線粒體超氧陰離子水平，熒光定量PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)western blot檢測抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2的表達(dá)線粒體新生相關(guān)蛋白PGC-1αNRF-1COXⅠ和SDH-A的表達(dá)，同時(shí)檢測細(xì)胞LDH漏出率ATP水平。 DOX致細(xì)胞毒性和線粒體毒性時(shí)效關(guān)系檢測：DOX染毒分為125和1000nM組，檢測時(shí)間點(diǎn)設(shè)為013612和24h，，檢測指標(biāo)分別為：細(xì)胞存活率LDH漏出ATP水平以及抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2的表達(dá)線粒體新生相關(guān)蛋白PGC-1α和NRF-1的表達(dá)。 2.DOX可能通過PGC-1α線粒體新生信號(hào)通路產(chǎn)生心肌細(xì)胞毒性 應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)將PCG-1α siRNA轉(zhuǎn)入AC16細(xì)胞，建立PCG-1α敲降細(xì)胞模型。細(xì)胞存活率檢測和LDH漏出檢測：分別采用正常AC16細(xì)胞模型和PCG-1α敲降A(chǔ)C16細(xì)胞模型，DOX染毒分為對(duì)照組31.2562.51252505008001000和2000nM組，染毒時(shí)間為12h。其他檢測指標(biāo)同第1小節(jié)，采用的細(xì)胞模型為正常AC16細(xì)胞模型和PCG-1α敲降A(chǔ)C16細(xì)胞模型，染毒組為對(duì)照組，DOX125nM和1000nM組。 3.PGC-1α與低劑量DOX誘導(dǎo)的O2之間可能存在負(fù)反饋機(jī)制并影響細(xì)胞毒性 應(yīng)用MitoTEMPO預(yù)處理細(xì)胞30min，隨后與DOX共同孵育12h，以未經(jīng)MitoTEMPO預(yù)處理細(xì)胞和共孵育的細(xì)胞為對(duì)照，分別設(shè)DOX0125和1000nM劑量組，檢測指標(biāo)同第1小節(jié)。 結(jié)果： 第一部分清醒小型豬心血管遙測模型替代清醒比格犬模型在藥物心血管安全藥理學(xué)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用 1．清醒小型豬和清醒比格犬遙測模型的建立小型豬和比格犬實(shí)施植入手術(shù)后均恢復(fù)良好，在恢復(fù)期動(dòng)物體溫?zé)o升高，無感染，無合并癥，一般狀態(tài)良好。21d恢復(fù)期過后，兩種動(dòng)物均可在清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下監(jiān)測到心血管系統(tǒng)參數(shù)和體溫等參數(shù)，提示清醒小型豬和清醒比格犬遙測模型的建立。 2．模擬給藥喂食對(duì)清醒小型豬和比格犬心血管系統(tǒng)的影響 心電圖質(zhì)量：在整個(gè)監(jiān)測周期中，遙測小型豬的心電圖質(zhì)量明顯優(yōu)于遙測比格犬心電圖的質(zhì)量（P＜0.05）。模擬給藥和喂食后，遙測小型豬心電圖質(zhì)量恢復(fù)到基線水平的時(shí)間明顯短于遙測犬恢復(fù)到基線水平所需的時(shí)間。 心率：模擬給藥后，遙測小型豬和比格犬的心率都明顯加快，但小型豬心率恢復(fù)到基線的時(shí)間明顯短于遙測犬（P＜0.05）。喂食后，比格犬心率在45min內(nèi)恢復(fù)到基線水平，而小型豬心率維持在較高的水平，在4h左右恢復(fù)到正常水平。在12h/12h晝夜循環(huán)周期內(nèi)，在喂食組中，并未觀察到比格犬的心率具有明顯的晝夜節(jié)律性（P＞0.05），而小型豬的心率具有明顯的晝夜節(jié)律性（P＜0.05）。非喂食組的心率數(shù)據(jù)證實(shí)該晝夜節(jié)律性是由于喂食引起的。 血壓：模擬給藥和喂食都可引起遙測小型豬和比格犬平均動(dòng)脈血壓升高，模擬給藥和喂食后，小型豬的血壓恢復(fù)到基線水平所需要的時(shí)間都明顯短于比格犬（P＜0.05）。在兩種動(dòng)物中，未觀察到血壓具有明顯地晝夜節(jié)律性。 活動(dòng)度：模擬給藥和喂食都可引起遙測小型豬和比格活動(dòng)度明顯升高（P＜0.05），模擬給藥和喂食后，小型豬的活動(dòng)度恢復(fù)到基線水平所需要的時(shí)間都明顯短于比格犬（P＜0.05）。無論喂食與否，兩種動(dòng)物的活動(dòng)都具有明顯的晝夜節(jié)律性（P＜0.05）。 體溫：在喂食組和非喂食組，都觀察到遙測小型豬的體溫具有明顯地晝夜節(jié)律性（P＜0.05），而遙測比格犬的體溫并沒有明顯地晝夜節(jié)律性。 第二部分DOX致心肌細(xì)胞線粒體損傷的作用機(jī)制研究及線粒體毒性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵通路的識(shí)別 1. DOX對(duì)AC16細(xì)胞線粒體新生的影響 量效關(guān)系：AC16細(xì)胞暴露于DOX24h后，IC50為4.9μM；DOX以9個(gè)劑量的濃度梯度作用于AC16細(xì)胞12h后，從125nM DOX染毒劑量開始，細(xì)胞存活率線粒體膜電位ATP水平均呈劑量依賴性降低（與對(duì)照相比P＜0.05）；而LDH漏出和細(xì)胞線粒體內(nèi)超氧陰離子水平呈劑量依賴性增加（與對(duì)照相比P＜0.05）；而線粒體新生相關(guān)蛋白線粒體新生和抗氧化蛋白在DOX染毒劑量小于等于125nM時(shí)，均出現(xiàn)誘導(dǎo)（與對(duì)照相比P＜0.05），當(dāng)劑量大于250nM時(shí)，隨著劑量的增加，呈現(xiàn)劑量依賴性的下降（與對(duì)照相比P＜0.05）。 時(shí)效關(guān)系：在125nM DOX暴露后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未觀察到細(xì)胞存活率LDH漏出ATP水平線粒體膜電位和線粒體超氧陰離子水平有明顯變化，而抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及線粒體新生相關(guān)蛋白PGC-1α和NRF-1在DOX暴露3h后的表達(dá)均呈劑量依賴性增加，約在24h達(dá)到峰值。在125nM DOX暴露1h后未觀察到細(xì)胞存活率LDH漏出ATP水平有明顯變化，此時(shí)抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及線粒體新生相關(guān)蛋白PGC-1α和NRF-1表達(dá)增加；從暴露第3h開始細(xì)胞存活率LDH漏出和ATP水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降，在第24h達(dá)到低谷水平，而此時(shí)抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及線粒體新生相關(guān)蛋白PGC-1α和NRF-1表達(dá)也呈時(shí)間依賴性下降。 2. DOX可能通過PGC-1α線粒體線粒體新生信號(hào)通路產(chǎn)生心肌細(xì)胞毒性 與正常細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)入PGC-1αsiRNA20pM的細(xì)胞PGC-1α蛋白表達(dá)明顯降低，約為對(duì)照的50%左右，且隨PGC-1αsiRNA轉(zhuǎn)染劑量加大，PGC-1α蛋白表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性的降低。PGC-1α敲降細(xì)胞在暴露于125nM DOX12h后即出現(xiàn)細(xì)胞存活率降低LDH漏出增加，隨著作用劑量的增加，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)劑量依賴性下降，LDH漏出呈現(xiàn)劑量依賴性增加，且在相同DOX作用劑量下，PGC-1α敲降細(xì)胞的損傷更為嚴(yán)重。DOX125nM染毒后，PGC-1α敲降細(xì)胞線粒體膜電位ATP生成抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及線粒體新生相關(guān)蛋白PGC-1α和NRF-1線粒體新生均受到抑制，細(xì)胞線粒體超氧陰離子水平升高，而正常細(xì)胞在該劑量下抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及線粒體新生相關(guān)蛋白PGC-1α和NRF-1誘導(dǎo)表達(dá)，線粒體膜電位ATP生成和線粒體超氧陰離子水平無明顯變化。DOX1000nM染毒12h后，正常AC16細(xì)胞和PGC-1α敲降細(xì)胞線粒體膜電位ATP生成抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及線粒體新生相關(guān)蛋白PGC-1α和NRF-1線粒體新生均受到抑制，但PGC-1α敲降細(xì)胞抑制更為嚴(yán)重，在該劑量下PGC-1α敲降細(xì)胞線粒體超氧陰離子水平要明顯高于正常細(xì)胞。 3. PGC-1α與低劑量DOX誘導(dǎo)的O2之間可能存在負(fù)反饋機(jī)制并影響細(xì)胞毒性 與未經(jīng)MitoTEMPO處理的細(xì)胞相比，經(jīng)MitoTEMPO處理的細(xì)胞暴露于125nM DOX12h后，線粒體新生相關(guān)蛋白抗氧化蛋白和線粒體新生均未誘導(dǎo)，與對(duì)照維持在相同水平，也未觀察到細(xì)胞存活率LDH漏出線粒體膜電位和超氧陰離子ATP水平有明顯變化。暴露于1000nM DOX12h后，經(jīng)MitoTEMPO處理的細(xì)胞和未經(jīng)MitoTEMPO處理的細(xì)胞線粒體新生相關(guān)蛋白表達(dá)抗氧化蛋白表達(dá)和線粒體新生細(xì)胞存活率線粒體膜電位和ATP水平均顯著降低，但未經(jīng)MitoTEMPO處理的細(xì)胞降低程度更甚，在該劑量下，LDH漏出和線粒體超氧陰離子均增加，而未經(jīng)MitoTEMPO處理的細(xì)胞增加的幅度更大。 結(jié)論： 第一部分清醒小型豬心血管遙測模型替代清醒比格犬模型在藥物心血管安全藥理學(xué)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用 清醒小型豬的心電圖質(zhì)量，血壓，活動(dòng)度等指標(biāo)在模擬給藥和喂食后恢復(fù)到基線水平所需的時(shí)間明顯短于清醒比格犬模型，提示清醒遙測小型豬可以替代比格犬用于化合物的心血管安全性評(píng)價(jià)。但鑒于喂食對(duì)小型豬心率的持久影響，在實(shí)驗(yàn)開展前至少應(yīng)提前4h禁食或者盡量避開受試物的Tmax喂食動(dòng)物。另外，當(dāng)受試化合物可能對(duì)體溫有影響時(shí)，應(yīng)盡量避免使用清醒小型豬作為評(píng)價(jià)模型。 第二部分DOX致心肌細(xì)胞線粒體損傷的作用機(jī)制研究及線粒體毒性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵通路的識(shí)別 1. DOX對(duì)AC16細(xì)胞的細(xì)胞毒性和線粒體毒性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性；DOX對(duì)線粒體新生有雙向影響，可能與PGC-1α信號(hào)通路密切相關(guān)。 2. PGC-1α線粒體新生信號(hào)通路是參與調(diào)控DOX致心肌細(xì)胞毒性的關(guān)鍵通路，DOX對(duì)PGC-1α具有雙向的調(diào)節(jié)作用，即相對(duì)低劑量的DOX誘導(dǎo)PGC-1α的表達(dá)，一方面與NRF-1共激活，通過TFAM促進(jìn)線粒體新生，另一方面PGC-1α的誘導(dǎo)可激活抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2，使線粒體內(nèi)的超氧陰離子平衡，細(xì)胞和線粒體功能得以維持；而在高劑量DOX暴露后可抑制PGC-1α的表達(dá)，一方面線粒體新生受到抑制，另一方面PGC-1α的低表表可抑制抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2，使線粒體內(nèi)的超氧陰離子續(xù)集，形成惡性循環(huán)，細(xì)胞和線粒體功能受損。 3. PGC-1α信號(hào)通路在DOX致心肌細(xì)胞毒性的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用，是決定細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)和毒性發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，這為開發(fā)預(yù)防和治療DOX臨床心臟毒性的藥物提供了潛在的指導(dǎo)；PGC-1α信號(hào)通路在DOX致心肌細(xì)胞毒性中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，該通路可能是心臟毒性的潛在“毒性通路”。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R114

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 林衛(wèi)華;吳志剛;;我國近年食品毒理學(xué)應(yīng)用與研究進(jìn)展[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2014年08期

2 張秀娟;白雪瑩;陸童;季宇彬;;雄黃對(duì)小鼠肝臟功能損傷的初步研究[J];中藥藥理與臨床;2014年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 黃劍平;藥物毒性預(yù)測方法研究[D];浙江大學(xué);2014年

本文編號(hào)：1812614