本文選題：NaAsO_2　切入點：人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在流行病學(xué)的研究報告中充分顯示無機砷為人類致癌物,長期無機砷暴露除引發(fā)皮膚癌外也會有肺癌、膀胱癌、肝癌等癌癥的發(fā)生。然而動物實驗尚未直接證實砷化物的致癌性。為進(jìn)一步了解無機砷的致癌性,并從人類皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞起源角度探索砷致皮膚癌發(fā)生的分子機制將為進(jìn)一步理解砷致皮膚癌發(fā)生發(fā)展的機理提供新的證據(jù),同時也為尋找對早期預(yù)防、早期診斷和治療有價值的新的分子標(biāo)記提供線索。由于皮膚是無機砷的主要靶組織,也是對砷毒性最敏感的組織之一,因此正常人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞對于砷毒性作用的研究具有重要的實際意義。HaCaT永生化的人角質(zhì)形成細(xì)胞株(以下簡稱HaCaT細(xì)胞)來源于正常人皮膚,與正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞分化特性相似,可無限傳代,但無致瘤性,是體外研究砷致癌等作用機制的理想模型。 因此本研究以HaCaT細(xì)胞為研究對象,采用存在于自然界中對人體毒性較大的三價無機砷：亞砷酸鈉(sodium arsenite, NaAsO2)進(jìn)行長期(30代,約4個月)、低濃度誘導(dǎo)其惡性轉(zhuǎn)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞至25代后(約100天),以皮下注射方式將細(xì)胞注射進(jìn)入到裸鼠左腋下,可見腫瘤的形成,腫瘤組織切片觀察判定是鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC),屬于砷引起皮膚癌的一種類型。長期低水平砷暴露誘導(dǎo)成致瘤性的HaCaT細(xì)胞群中可能“存在的”為數(shù)不多的具有自我更新能力、分化潛能的癌干細(xì)胞(Cancer stem cells, CSCs),而CD44v6是其潛在的特異性分子標(biāo)志物。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44v6的活化可能與NaAsO2對NF-κ B的激活和對P53的抑制有關(guān)。 采用基因芯片技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)分析NaAsO2處理導(dǎo)致致瘤性轉(zhuǎn)化的HaCaT細(xì)胞和同期配對的對照組HaCaT細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、免疫系統(tǒng)反應(yīng)、細(xì)胞生長、細(xì)胞粘附運動等生物過程的失調(diào)或改變在長期低濃度NaAsO2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。差異基因參與多條與腫瘤及癌干細(xì)胞密切相關(guān)的信號通路,如Wnt、MAPK、NOTCH、p53、cell cycle、apotosis、Jak-STAT、 TGF-beta、NF-κB、PI-3K/AKT等信號通路。與這些生物過程、信號通路密切相關(guān)的基因可能是砷致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵因子,如鼠類胸腺瘤病毒(v-akt)同源體2/β-rac蛋白激酶(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog2/protein kinase Bβ, AKT2),骨髓細(xì)胞瘤病毒同源的MYC原癌基因(v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog, MYC), MDM2癌基因(Mdm2p53binding protein homolog, murine double mimute2, MDM2),細(xì)胞周期蛋白D3(cyclin D3, CCND3),絲裂原活化蛋白激酶3K14(mitogen-activated protein kinase kinase kinase14, MAP3K14), Jak蛋白酪氨酸激酶-1(Janus kinase1, JAK1),基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase9, MMP9), PTEN抑癌基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN), ATM抑癌基因(Ataxia telangiectasia mutated, ATM),信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子5A(Signal transducer and activator of transcription5A, STAT5A), Rho相關(guān)蛋白激酶2(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase2, ROCK2)等。 第一章長期低濃度砷劑誘引角質(zhì)形成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究 為進(jìn)一步了解無機砷的致癌性,因此利用0.05ppm(約0.4μM)NaAsO2處理人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT)大約4個月,探討暴露在長時間低濃度無機砷下的HaCaT細(xì)胞的生長情形,誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化,為進(jìn)一步探索、分析轉(zhuǎn)化過程中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)變化和基因表達(dá)譜的變化提供基礎(chǔ)。 HaCaT細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基DMEM。長時間細(xì)胞培養(yǎng)的做法是接種5×105個HaCaT細(xì)胞于100ml培養(yǎng)瓶中并且分別處理0,0.05ppm NaAsO2,當(dāng)滿2天時更換新的DMEM培養(yǎng)液,滿4天時則進(jìn)行隔代培養(yǎng)。總共隔代培養(yǎng)30代,約4個月中NaAsO2持續(xù)存在于DMEM培養(yǎng)液中。細(xì)胞培養(yǎng)期間,倒置顯微鏡下觀察每代細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照。并進(jìn)行軟瓊脂克隆形成率(Colony-forming efficiency, CFE)等實驗驗證細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、應(yīng)用MTT法測定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖能力、流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞周期、并將惡性轉(zhuǎn)化和同期配對傳代的對照組HaCaT細(xì)胞注射于Balb/c裸鼠左側(cè)腋窩皮下,觀察腫瘤形成情況,并作組織切片、HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)鑒定。 NaAsO2處理HaCaT細(xì)胞至25代后(約100天),以皮下注射方式將細(xì)胞打入裸鼠左腋下,可見腫瘤的形成。并且借由觀察腫瘤組織切片判定是鱗狀細(xì)胞癌,是砷引起皮膚癌的一種類型。經(jīng)長期低濃度無機砷刺激的HaCaT細(xì)胞發(fā)生了致瘤性轉(zhuǎn)化。此外,HaCaT細(xì)胞還有下列幾項的變化：(1)軟瓊脂克隆形成實驗表明NaAs02長期低濃度處理的細(xì)胞具有了非停泊性依賴生長的特性。(2)光鏡下觀察到細(xì)胞于培養(yǎng)瓶內(nèi)長滿時有較高的細(xì)胞密度,出現(xiàn)排列紊亂、重疊交叉生長現(xiàn)象,并出現(xiàn)多核巨細(xì)胞。(3)MTT檢測結(jié)果表明長期低濃度NaAs02處理的HaCaT細(xì)胞的增殖能力較對照組細(xì)胞明顯增強。(4)NaAsO2處理的HaCaT細(xì)胞較未處理的細(xì)胞有更多的細(xì)胞處于細(xì)胞周期的S、G2/M期,說明受NaAsO2處理細(xì)胞的增殖能力旺盛。 本部分實驗成功建立了低水平NaAsO2慢性處理所致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型,從而為進(jìn)一步探討砷化物所致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化分子機制提供了基礎(chǔ)。 第二章長期低濃度砷劑誘引角質(zhì)形成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)及意義 本部分旨在探討腫瘤干細(xì)胞在砷致人角質(zhì)形成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及其影響因素,以期發(fā)現(xiàn)或揭示砷致皮膚癌過程中的腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。分別對第0,5,10,15,20,25,30代低濃度NaAsO2處理的HaCaT細(xì)胞和同期配對的對照組HaCaT細(xì)胞滴片進(jìn)行熒光免疫組化(Immunofluorescence, IF)染色；同時提取上述不同時間點兩組細(xì)胞的總蛋白,利用蛋白印跡(Western blotting, WB)等實驗技術(shù)對可能存在的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行篩選,與其他檢測指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析。并分析其影響因素。 結(jié)果顯示,長期低濃度NaAsO2處理的HaCaT細(xì)胞中,腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44v6蛋白含量有逐漸增加的表現(xiàn)；對照組CD44v6蛋白含量未發(fā)現(xiàn)明顯變化。惡性轉(zhuǎn)化的HaCaT細(xì)胞(第25代)其CD44v6蛋白含量比同期對照組HaCaT細(xì)胞(第25代)顯著增加(P0.05)。NaAsO2處理組HaCaT細(xì)胞在15代后,CD44v6陽性表達(dá)顯著增加,定位于細(xì)胞膜,在25代和30代約有8%的陽性率。對CD44v6的表達(dá)與軟瓊脂克隆陽性率之間的關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),r=0.949,P=0.01,兩者呈正相關(guān)性。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44v6表達(dá)變化可能與砷致NF-κB激活、P53抑制有關(guān)。 實驗結(jié)果提示,長期低水平砷暴露所致皮膚損傷或癌組織中可能“存在的”為數(shù)不多的具有自我更新能力、分化潛能的癌干細(xì)胞,而CD44v6是其潛在的特異性分子標(biāo)志物。腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44v6的活化可能與NaAsO2對NF-K B的激活和對P53的抑制有關(guān)。 第三章長期低濃度砷劑誘引角質(zhì)形成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因表達(dá)變化 本部分實驗?zāi)康氖翘接慛aAsO2誘引人類皮膚細(xì)胞HaCaT惡性轉(zhuǎn)化過程中基因表達(dá)譜的改變,分析差異基因的生物學(xué)意義,進(jìn)而揭示在NaAsO2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化過程中可能起關(guān)鍵作用的生物學(xué)通路和分子,為理解砷暴露致皮膚癌發(fā)生的分子機制提供線索。實驗方法：提取正常HaCaT細(xì)胞和轉(zhuǎn)化HaCaT細(xì)胞的總RNA,應(yīng)用高通量的基因芯片技術(shù)分析轉(zhuǎn)化HaCaT細(xì)胞和正常對照HaCaT細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變,運用實時定量PCR技術(shù)驗證芯片的結(jié)果,并結(jié)合生物信息學(xué)分析對差異基因進(jìn)行功能分類,同時探討差異基因之間以及差異基因與其他基因之間可能的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),惡性轉(zhuǎn)化的HaCaT細(xì)胞和正常對照HaCaT細(xì)胞共發(fā)現(xiàn)2,871個表達(dá)差異基因(P0.05時,差異倍數(shù)≥2),約占芯片探針總數(shù)的6.1%(2,871/44,000)。其中1,415個基因表達(dá)上調(diào),1,456個基因表達(dá)下調(diào)。其中表達(dá)上調(diào)的基因包括鼠類胸腺瘤病毒(v-akt)同源體2/β-rac蛋白激酶(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog2/protein kinase Bβ,AKT2),骨髓細(xì)胞瘤病毒同源的MYC原癌基因(v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog, MYC), MDM2癌基因(Mdm2p53binding protein homolog, murine double mimute2, MDM2),細(xì)胞周期蛋白D3(cyclin D3, CCND3),絲裂原活化蛋白激酶3K14(mitogen-activated protein kinase kinase kinase14, MAP3K14)等；表達(dá)下調(diào)的基因有Jak蛋白酪氨酸激酶-1(Janus kinase1, JAK1),基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase9, MMP9), PTEN抑癌基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN),ATM抑癌基因(Ataxia telangiectasia mutated, ATM),信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子5A(Signal transducer and activator of transcription5A,STAT5A), Rho相關(guān)蛋白激酶2(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase2, ROCK2)等。實時熒光定量PCR分析上述基因在兩組細(xì)胞中的表達(dá),進(jìn)一步證實了芯片結(jié)果的可靠性。用Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫將差異基因進(jìn)行功能注釋,結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因產(chǎn)物主要參與細(xì)胞增殖(cell proliferation)、免疫系統(tǒng)反應(yīng)(immune system process).細(xì)胞生長(cell development)、細(xì)胞粘附(cell adhesion)等與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)密切的功能調(diào)節(jié)。KEGG和Biocarta數(shù)據(jù)庫分析差異基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò),結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因參與多條信號通路,其中已知Wnt、MAPK、NOTCH、p53、cell cycle、apotosis、Jak-STAT、TGF-beta、 NF-κB、PI-3K/AKT等信號通路與腫瘤及癌干細(xì)胞密切相關(guān)。AKT2, JAK1, MMP9, MYC, PTEN, ATM, MDM2, STAT5A, CCND3, MAP3K14和ROCK2等與多條通路有關(guān),可能在NaAsO2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。 以上結(jié)果提示：長期低濃度NaAsO2處理直接引起HaCaT細(xì)胞基因表達(dá)改變,砷暴露導(dǎo)致的細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘附運動失衡或改變在其誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化過程中可能發(fā)揮重要作用,Wnt、MAPK等多條信號通路參與砷誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化過程,AKT2, JAK1, MMP9, MYC, PTEN, ATM, MDM2, STAT5A, CCND3, MAP3K14和ROCK2等基因可能是這一過程中的關(guān)鍵分子。 結(jié)論 1.人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT在長期低水平NaAsO2作用下發(fā)生了致瘤性轉(zhuǎn)化。 2.長期低水平砷暴露誘導(dǎo)成致瘤性的HaCaT細(xì)胞群中可能“存在的”為數(shù)不多的具有自我更新能力、分化潛能的癌干細(xì)胞,而CD44v6是其潛在的特異性分子標(biāo)志物。 3.腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44v6的活化可能與NaAsO2對NF-κB的激活和對P53的抑制有關(guān)。 4.分析了正常HaCaT細(xì)胞、轉(zhuǎn)化HaCaT細(xì)胞的基因表達(dá)變化。在轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生改變的基因主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、免疫反應(yīng)、細(xì)胞粘附運動等生物學(xué)過程；以及Wnt、MAPK、NOTCH、p53、cell cycle、apotosis、Jak-STAT、 TGF-beta、NF-kB、PI-3K/AKT等多條信號通路；AKT2, JAK1, MMP9, MYC, PTEN, ATM, MDM2, STAT5A, CCND3, MAP3K14和ROCK2等基因可能是轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵分子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1637089