本文關(guān)鍵詞： 三鄰甲苯磷酸酯(TOCP) 有機(jī)磷酯類化合物誘發(fā)的遲發(fā)性神經(jīng)病(OPIDN) 線粒體 凋亡 自噬相關(guān)蛋白　出處：《山東大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 有機(jī)磷化合物(organophosphorus compounds, OPs)應(yīng)用廣泛,主要用作農(nóng)藥、增塑劑、阻燃劑、油料添加劑、潤滑劑及神經(jīng)毒劑等。有機(jī)磷化合物除可抑制膽堿酯酶而誘發(fā)急性中毒外,部分有機(jī)磷化合物還能誘發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)病(organophosphate induced delayed neurotoxicity, OPIDN)。OPIDN的特點(diǎn)是在接觸有機(jī)磷化合物1-3周后出現(xiàn)癥狀。首發(fā)癥狀多為感覺異常,很快發(fā)展為運(yùn)動(dòng)性肌無力與共濟(jì)失調(diào),嚴(yán)重者可癱瘓。臨床上尚無特效治療方法,主要是對癥支持治療,預(yù)后差。三鄰甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresylphosphate TOCP)是典型的具有遲發(fā)性神經(jīng)毒性的有機(jī)磷化合物,能在人和敏感動(dòng)物中誘發(fā)OPIDN. TOCP誘導(dǎo)OPIDN的發(fā)病機(jī)制尚無明確定論,目前國內(nèi)外研究多集中于神經(jīng)元軸索,對于神經(jīng)元胞體在OPIDN發(fā)病過程中的病理變化少有報(bào)導(dǎo)。近年來國內(nèi)外學(xué)者研究表明TOCP誘導(dǎo)的OPIDN中發(fā)生了神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象,但是細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制目前尚不清楚,因此TOCP中毒所致神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡機(jī)制需要進(jìn)行深入研究。 本研究通過建立TOCP中毒動(dòng)物模型,在細(xì)胞凋亡的線粒體通路上探索染毒母雞脊髓組織神經(jīng)元凋亡的發(fā)生機(jī)制,進(jìn)一步研究神經(jīng)元凋亡在OPIDN中的作用,探索OPIDN的發(fā)病機(jī)制。 方法 1.TOCP誘導(dǎo)母雞OPIDN動(dòng)物模型的建立 將60只成年羅曼母雞適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為5組,即對照組、1d、5d、10d和21d組(n=12)。TOCP溶解于玉米油中,按750mg/kg經(jīng)灌胃一次性染毒,對照組給予等體積玉米油。最后在上述時(shí)間點(diǎn)從各組中隨機(jī)抽選3只母雞,取脊髓前角組織用于電鏡觀察。另在每組剩余的動(dòng)物中隨機(jī)抽取3只母雞,取脊髓前角組織用于原位末端標(biāo)記(TUNEL)實(shí)驗(yàn)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。剩余各組動(dòng)物在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死,迅速取出脊髓,置于液氮中,-80℃保存,用于SDS-PAGE和Western-Blotting實(shí)驗(yàn)。 2.脊髓組織中神經(jīng)元凋亡變化的測定 取腰段脊髓前角組織環(huán)氧樹脂組織切片,透射電鏡下觀察神經(jīng)元凋亡的變化。另取腰段脊髓前角石蠟組織切片,應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)測定脊髓組織中神經(jīng)元凋亡數(shù)量的變化。 3.脊髓神經(jīng)元細(xì)胞色素C (Cytochrome C)蛋白由線粒體向胞漿釋放的測定 取母雞脊髓組織,按照組織線粒體分離試劑盒說明書分離出線粒體蛋白和胞漿蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blotting技術(shù)分別測定兩種組分中細(xì)胞色素C蛋白的含量。另取腰段脊髓前角石蠟組織切片,免疫組織化學(xué)法測定細(xì)胞色素C蛋白在脊髓神經(jīng)元胞漿中含量的變化。 4.脊髓組織中凋亡相關(guān)蛋白的測定 取母雞脊髓組織,按質(zhì)量體積比1：5加入預(yù)冷的的勻漿緩沖液(50mM Tris-HC1,150mM NaCl,1%Triton X-100,1%sodium deoxycholate,0.1%sodium dodecyl sulphate (SDS),1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF),1mMNa3VO4,5mMNaF,和1%cocktail protein protease inhibitors, pH=7.5),制備組織勻漿,14000轉(zhuǎn)/分,4℃離心20min,取上清。利用SDS-PAGE和Western-blotting技術(shù)測定脊髓組織總蛋白中Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Cytochrome C、pro-caspase3和pro-caspase9蛋白的含量。另取母雞脊髓組織,按照細(xì)胞核分離試劑盒說明書分離出胞核蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blott ing技術(shù)測定脊髓胞核中cleaved-PARP蛋白表達(dá)的變化。 5.脊髓組織中自噬相關(guān)蛋白的測定 按照上面方法取母雞脊髓組織總蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blotting技術(shù)測定脊髓中Atg5、Atg7、Atg12、Beclin-1、AMBRA1和VPS34蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀況變化 給予TOCP染毒后,動(dòng)物未出現(xiàn)急性中毒癥狀,約在第5d出現(xiàn)雙腿運(yùn)動(dòng)輕微不協(xié)調(diào),第9d出現(xiàn)嚴(yán)重的、頻發(fā)的站立和行走困難,之后OPIDN癥狀進(jìn)展迅速,第15d所有動(dòng)物完全癱瘓,此狀態(tài)持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。正常對照組活動(dòng)正常,未見任何異常。 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓神經(jīng)元凋亡的變化 電鏡觀察結(jié)果顯示,TOCP染毒后母雞脊髓神經(jīng)元凋亡的變化隨時(shí)間呈現(xiàn)逐漸加重的現(xiàn)象。染毒1d時(shí),神經(jīng)元胞核異型化,核基質(zhì)中可見異染色質(zhì),部分線粒體出現(xiàn)空泡。5d鏡下可見神經(jīng)元電子密度增高,這是細(xì)胞凋亡或靜息的標(biāo)志。10d可見神經(jīng)元電子密度增高,線粒體腫脹,細(xì)胞核異型性明顯。至21d神經(jīng)元電子密度進(jìn)一步增高,提示凋亡的神經(jīng)元或靜息狀態(tài)的神經(jīng)元。 TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TOCP染毒后5d開始見到有凋亡神經(jīng)元,隨染毒時(shí)間延長凋亡神經(jīng)元數(shù)目增多,21d時(shí)達(dá)到最多。 3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓神經(jīng)元中Cytochrome C蛋白由線粒體向胞漿釋放的變化 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,各組脊髓前角組織均見到Cytochrome C蛋白陽性染色,呈棕黃色顆粒,陽性信號定位于神經(jīng)元胞質(zhì),對照組的陽性染色較弱,隨染毒時(shí)間的延長,陽性染色逐漸加深,5d組染色深度達(dá)到頂峰,10d和21d組有所下降,但仍高于對照組。與對照組相比,脊髓神經(jīng)元胞漿中Cytochrome C含量在1、5、10和21d分別升高了135.17%(P0.05)、242.86%(P0.05)、14.29%(P0.05)和64.29%(P0.05)。 Western-blotting結(jié)果顯示,與對照組相比,總蛋白中Cytochrome C含量在TOCP染毒后1、5、10、21d分別升高了50.9%(P0.05)、59.5%(P0.05)、62.3%(P0.05)和22.3%(P0.05)；胞漿中Cytochrome C含量在TOCP染毒后1、5、10、21d分別升高了115.6%(P0.05)、125.5%(P0.05)、63.8%(P0.05)和49.5%(P0.05)；線粒體中Cytochrome C含量在TOCP染毒后1、5、10、21d分別下降了28.7%(P0.05)、66.9%(P0.05)、45.8%(P0.05)和24.7%(P0.05)。 4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓組織中凋亡相關(guān)蛋白的變化 Western Blot檢測結(jié)果顯示TOCP染毒顯著影響了母雞脊髓組織中神經(jīng)元凋亡因子的表達(dá),與對照組相比,Bcl-2含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分別下降了19.9%(P0.05)、30.6%(P0.05)、43.6%(P0.05)和33.3%(P0.05); Bax含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分別升高了28.1%(P0.05)、31.5%(P0.05)、28%(P0.05)和16.07%；Bcl-x1含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分別下降了37.7%(P0.05)、48.1%(P0.05)、51.1%(P0.05)和7.77%；pro-caspase9含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分別下降了34.1%(P0.05)、40.3%(P0.05)、27%(P0.05)和22.6%(P0.05); pro-caspase3含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分別下降了33.9%(P0.05)、58.1%(P0.05)、64.5%(P0.05)和35.1%(P0.05)；胞核蛋白Cleaved-PARP含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分別升高了130.6%(P0.05)、150.5%(P0.05)、140%(P0.05)和138.3%(P0.05)。 5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓組織中自噬相關(guān)蛋白的變化 Western Blot檢測結(jié)果顯示TOCP染毒顯著抑制了母雞脊髓組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。與對照組相比,脊髓中Atg5含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分別下降了32.7%(P0.05)、51.5%(P0.05)、47.3%(P0.05)和39.6%(P0.05); Atg12含量在TOCP染毒后5、10天分別下降了33.9%(P0.05)和25.4%(P0.05)；Beclin1含量在TOCP染毒后1、5、10、21天分別下降了28.9%(P0.05)、50.2%(P0.05)、43.2%(P0.05)和28.3(P0.05)；AMBRA1含量在TOCP染毒后1、5、10天分別下降了21.5%(P0.05)、31.7%(P0.05)和22.7%(P0.05); Atg7和VPS34含量在TOCP染毒后整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中沒有顯著變化(P0.05)。 結(jié)論 1. TOCP誘導(dǎo)OPIDN的發(fā)生發(fā)展過程中,母雞脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。 2. TOCP染毒干擾了母雞脊髓組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Bax、 Cytochrome C、pro-caspase3、pro-caspase9和cleaved-PARP的表達(dá). 3. TOCP誘導(dǎo)OPIDN的發(fā)病機(jī)制涉及到神經(jīng)元線粒體凋亡通路的激活。 4.線粒體凋亡通路的激活可能與自噬活性的抑制有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1534184