發(fā)布時間：2018-02-17 07:41

  本文關(guān)鍵詞： 花椒麻素 蛋白質(zhì)合成代謝 蛋白質(zhì)分解代謝 糖尿病 機(jī)制　出處：《西南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：花椒(Z.bungeanum maxim)是我國及世界上部分國家重要的、較為廣泛食用的天然香辛料和中藥配料,其有效成分為花椒呈香和呈味成分。其中,花椒的呈味成分為花椒麻味物質(zhì),也稱為花椒麻素,是一類存在于花椒中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的重要活性成分(酰胺類物質(zhì)),具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎止痛以及抗血小板凝集等多種生理活性。近年來的研究表明,花椒麻素可促進(jìn)體內(nèi)脂肪的氧化,減少脂肪沉積和血清中甘油三酯濃度的作用;另外,花椒麻素還可通過抑制糖異生作用,減少肝糖的輸出,并能修復(fù)胰島功能,促進(jìn)胰島素的分泌來改善鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘異的糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂。雖然花椒麻素對人體的功能作用已有一定的研究,但仍存在較多不明確的問題,尤其是對體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解代謝方面的作用等方面研究甚少�，F(xiàn)有研究表明,蛋白質(zhì)合成代謝及分解代謝作用都依賴于mTOR途徑,這意味著mTOR可能作為蛋白質(zhì)合成與分解過程的交叉位點(diǎn),通過對下游分子的表達(dá)調(diào)控,起到調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的作用。而mTOR的活化受上游多個信號通路(受營養(yǎng)因子、生長因子、能量)所介導(dǎo),其中腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)可負(fù)向調(diào)控mTOR。泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin proteasome pathway,UPP)通過三酶級聯(lián)反應(yīng)將泛素連接于靶蛋白使其泛素化,介導(dǎo)了真核生物80%-85%的蛋白降解。然而花椒麻素對機(jī)體蛋白質(zhì)合成和分解代謝的影響如何?以何種刺激信號(營養(yǎng)因子、生長因子、能量等)去影響?等均不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用大鼠動物在體實(shí)驗(yàn),采用qPCR和western-blot等技術(shù)從核酸水平和蛋白水平探明花椒麻素對不同體質(zhì)(健康、糖尿病-Ⅰ型)大鼠個體的機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝的mTOR途徑、AMPK途徑和分解代謝的UPP途徑的影響,最終明確花椒麻素對機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解代謝的影響及機(jī)制,并建立起一套研究生物活性物質(zhì)對蛋白質(zhì)代謝影響分子機(jī)制的技術(shù)與方法體系。其主要研究結(jié)果如下:(1)花椒麻素對健康SD試驗(yàn)大鼠機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的影響研究將32只健康SD雄性大鼠按體重隨機(jī)分為空白對照組(Control),花椒麻素的大豆油溶液高劑量灌胃試驗(yàn)組8mg/(kg.d)(HDG)、中劑量灌胃試驗(yàn)組4mg/(kg.d)(MDG)和低劑量灌胃試驗(yàn)組2mg/(kg.d)(LDG),每組各8只,試驗(yàn)期為28天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,測定試驗(yàn)大鼠血清、肝臟、骨骼肌和空腸等組織中與機(jī)體蛋白質(zhì)代謝直接相關(guān)的生理生化指標(biāo)、代謝酶的活性和激素的水平等的變化;qPCR檢測其骨骼肌中肌細(xì)胞生成素(myogenin,My OG)、肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)、鈣蛋白酶-1(μ-calpain,CAPN-1)、鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,以探討花椒麻素對健康SD試驗(yàn)大鼠機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對照組相比,花椒麻素可顯著(p0.05)提高大鼠相對骨骼肌的重量,可顯著(p0.05)降低腹脂率,但對其它臟器的相對重量影響不顯著(P0.05);顯著(p0.05)增加試驗(yàn)大鼠血清中總蛋白、白蛋白和球蛋白的含量,但對白蛋白/球蛋白比值的影響不顯著(P0.05);顯著(p0.05)降低試驗(yàn)大鼠血尿氮(BUN)的含量,但對大鼠血清Cr含量的影響不顯著(P0.05);顯著(p0.05)升高血清中三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine,T3)和胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-I)的含量,但對血清中甲狀腺素(thyroxine,T4),白細(xì)胞介素6(interleukin,IL-6)和胰島素(insulin,Ins)的影響不顯著(P0.05);中、高劑量試驗(yàn)組的花椒麻素可顯著(p0.05)提高大鼠空腸刷狀緣γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase,γ-GT)活性和空腸氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)活性(p0.05),但對空腸羧肽酶A(Carboxypeptidase,CPA)和二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)活性的影響不顯著(P0.05);顯著(p0.05)升高試驗(yàn)大鼠骨骼肌中RNA的含量(p0.05),而對大鼠骨骼肌中DNA含量無顯著影響(P0.05),高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組顯著(p0.05)提高骨骼肌中RNA/DNA比值。此外,花椒麻素可顯著(p0.05)上調(diào)大鼠骨骼肌中IGF-Ⅰ、My OG、CAPN-1和CAST mRNA表達(dá)量,顯著(p0.05)下調(diào)MSTN mRNA表達(dá)量。結(jié)果提示:灌胃適當(dāng)劑量的花椒麻素可顯著增加試驗(yàn)大鼠的相對骨骼肌重,減少腹脂的沉積;顯著降低體重;說明花椒麻可通過調(diào)節(jié)能量分配來改變試驗(yàn)大鼠胴體的組成。適當(dāng)劑量的花椒麻素可顯著提高試驗(yàn)大鼠血清總蛋白的含量,顯著增強(qiáng)肝臟中GPT的活性,促進(jìn)機(jī)體蛋質(zhì)的合成代謝。另外,花椒麻素可通過上調(diào)My OG mRNA表達(dá)量的同時下調(diào)抑制基因MSTN mRNA表達(dá)量,促進(jìn)骨骼肌的生長;可由CAPN-1/CAST系統(tǒng)增強(qiáng)骨骼肌蛋白質(zhì)的更新,并促進(jìn)蛋白質(zhì)的沉積。其中,高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)沉積的效果比低劑量試驗(yàn)組顯著(p0.05)。(2)花椒麻素對健康SD試驗(yàn)大鼠氨基酸及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體影響的研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同(1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,測定試驗(yàn)大鼠血清、肝臟、骨骼肌及空腸中15種氨基酸的含量;應(yīng)用qPCR檢測空腸、骨骼肌、肝臟中相應(yīng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,以探討氨基酸及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體是否為花椒麻素對健康SD試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)沉積的信號因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對照組相比,花椒麻素可顯著(p0.05)升高試驗(yàn)大鼠血清和骨骼肌中Asp、Glu、Asn、Arg、Ser和Ala含量;顯著(p0.05)降低試驗(yàn)大鼠血清中Gln含量;顯著(p0.05)增加骨骼肌和空腸組織中Gln含量;肝臟中Gln含量有增加趨勢,但不顯著(P0.05)�；ń仿樗貙υ囼�(yàn)大鼠骨骼肌中BCAA的影響主要表現(xiàn)為降低其含量,其中高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組可顯著(p0.05)降低骨骼肌Ile的含量(p0.05)�；ń仿樗乜娠@著(p0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠空腸Pep T1、ECAA1、ASCT1和PAT1 mRNA表達(dá)量;顯著(p0.05)下調(diào)試驗(yàn)大鼠空腸CAT-1、y+LAT1、b0,+AT mRNA表達(dá)量,但對ATB0,+的影響不顯著(P0.05)。顯著(p0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠肝臟Pep T1、ASCT1和ECAA1 mRNA表達(dá)量;顯著(p0.05)上調(diào)骨骼肌PAT1 mRNA表達(dá)量,顯著(p0.05)下調(diào)ATF4、CD98和y+LAT1 mRNA表達(dá)量。結(jié)果提示:花椒麻素升高試驗(yàn)大鼠血清和骨骼肌中的生糖氨基酸,其主要來源于機(jī)體內(nèi)相應(yīng)α-酮酸自身合成導(dǎo)致。其中,高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組升高試驗(yàn)大鼠血清和骨骼肌中生糖氨基酸效果顯著高于低劑量試驗(yàn)組(p0.05)。綜合以上結(jié)果可知,氨基酸和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體并非花椒麻素影響試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)沉積的信號因子。(3)花椒麻素對健康SD試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)合成與分解代謝影響的機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同(1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用實(shí)時熒光定量及其蛋白免疫印跡技術(shù)檢測試驗(yàn)大鼠肝臟及骨骼肌中與蛋白質(zhì)合成與分解代謝的相關(guān)基因mRNA及其蛋白表達(dá)量,以進(jìn)一步探討花椒麻素對健康SD試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)合成與分解代謝影響的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對照組相比,花椒麻素可顯著(P0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠肝臟中IGF-I、mTOR、PI3K和PKB mRNA表達(dá)量,顯著(P0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠肝臟的mTOR,p-mTOR(Ser2448)、PI3K(p110)、PKB和p-PKB(Ser437)蛋白水平;顯著(P0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠骨骼肌IGF-I、mTOR、PI3K、PKB、TSC2 mRNA的表達(dá)量,顯著(P0.05)上調(diào)試驗(yàn)大鼠骨骼肌mTOR,p-mTOR(Ser2448)、PI3K(p110)、PKB、p-PKB(Ser437)和TSC2蛋白水平,而對AMPK、p-AMPK(Thr 172)和TSC1蛋白水平影響不顯著(P0.05)。另外,灌胃花椒麻素可顯著(P0.05)下調(diào)試驗(yàn)大鼠骨骼肌atrogin-1/MAFbx、Mu RF1、Fox O1、Fox O3和Fox O4 mRNA的表達(dá)量和蛋白水平。結(jié)果提示:花椒麻素對健康SD試驗(yàn)大鼠骨骼肌中AMPK途徑的影響不顯著(P0.05);可通過IGF-I→PI3K→PKB→mTOR途徑增加機(jī)體蛋白質(zhì)合成,并通過UPP途徑減少蛋白質(zhì)的分解。(4)花椒麻素對STZ誘導(dǎo)的糖尿病試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)代謝的影響和機(jī)制研究以40只雄性糖尿病試驗(yàn)大鼠為研究對象,并隨機(jī)分為空白對照組(Control),模型對照組(DM),高劑量灌胃8mg/(kg.d)(DM-HD)試驗(yàn)組、中劑量灌胃4mg/(kg.d)(DM-MD)試驗(yàn)組和低劑量灌胃2mg/(kg.d)(DM-LD)試驗(yàn)組,每組各8只,連續(xù)灌胃28 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,測定糖尿病試驗(yàn)大鼠血清、肝臟、骨骼肌和空腸等組織中與機(jī)體蛋白質(zhì)代謝直接相關(guān)的生理生化指標(biāo)、代謝酶的酶活和激素水平等的含量與變化;并采用qPCR和western-blot等技術(shù)檢測大鼠肝臟及骨骼肌中與蛋白質(zhì)合成與分解代謝相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)量,來探討花椒麻素對蛋白質(zhì)代謝紊亂的糖尿病試驗(yàn)大鼠的蛋白質(zhì)代謝影響與機(jī)制,以進(jìn)一步闡明花椒麻素對試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)代謝的影響與機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,花椒麻素可顯著(P0.05)降低糖尿病試驗(yàn)大鼠空腹血糖和果糖胺的含量,可緩解因糖尿病誘導(dǎo)的臟器腫大;顯著(P0.05)增加骨骼肌重量,顯著(P0.05)升高血清胰島素、IGF-I、總蛋白、白蛋白含量及球蛋白/白蛋白比值。顯著(P0.05)增加骨骼肌總蛋白、RNA含量及RNA/DNA比值;可顯著(P0.05)上調(diào)肝臟和骨骼肌IGF-I,IGF-IR和In R mRNA表達(dá)量;顯著(P0.05)上調(diào)骨骼肌PI3K、PKB和mTOR mRNA表達(dá)量;顯著(P0.05)下調(diào)骨骼肌atrogin-1/MAFbx、MURF1和Fox O mRNA表達(dá)量;顯著(P0.05)上調(diào)骨骼肌mTOR(total)、p-mTOR(ser2448、PKB(total)、p-PKB(ser437)和PI3K(p110)蛋白水平;顯著(P0.05)下調(diào)骨骼肌中atrogin-1/MAFbx、MURF1和Fox O蛋白表達(dá)量。結(jié)果提示:花椒麻素可改善因STZ誘導(dǎo)所致糖尿病大鼠機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂,其中高劑量試驗(yàn)組和中劑量試驗(yàn)組改善糖尿病大鼠機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂的效果顯著(P0.05)好于低劑量試驗(yàn)組。其機(jī)制可能為:花椒麻素可由Ins/IGF-I→PI3K→PKB→mTOR信號通路增加糖尿病試驗(yàn)大鼠蛋白質(zhì)合成,并通過UPP途徑降低蛋白質(zhì)的分解。(5)花椒麻素對糖尿病大鼠骨骼肌AMPK途徑的影響研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同(4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,測定糖尿病試驗(yàn)大鼠血清和肝臟中TG(triglyceride)、MDA(malondialdehyde)、TC(total cholesterol)和FFA(free fatty acid)含量及變化;并采用qPCR和western-blot檢測糖尿病試驗(yàn)大鼠骨骼肌中AMPK、SIRT1、ACC、GLUT4等相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)量,以探討花椒麻素對糖尿病大鼠骨骼肌AMPK途徑的影響及潛在機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,花椒麻素可顯著(P0.05)降低糖尿病試驗(yàn)大鼠血清中TG、MDA和FFA含量,顯著(P0.05)降低肝臟的TC、TG和MDA的含量。qPCR和western-blot檢測表明,花椒麻素對糖尿病試驗(yàn)大鼠骨骼肌AMPK mRNA有上調(diào)趨勢,但不顯著(P0.05);但顯著(P0.05)上調(diào)AMPK和p-AMPK(Thr172)蛋白質(zhì)表達(dá),顯著(P0.05)上調(diào)ACC mRNA表達(dá)和p-ACC(Ser79)蛋白質(zhì)表達(dá),同時顯著(P0.05)上調(diào)糖尿病大鼠骨骼肌細(xì)胞膜上GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果提示:花椒麻素可激活糖尿病大鼠骨骼肌AMPK信號通路,抑制ACC活性減少脂肪酸的形成;同時通過激活A(yù)MPK信號通路介導(dǎo)GLUT4快速轉(zhuǎn)位,提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率,降低血糖。因此,花椒麻素可通過激活A(yù)MPK途徑,改善糖尿病大鼠糖、脂及蛋白質(zhì)代謝紊亂�；ń仿樗貙μ悄虿〈笫蠊趋兰〉鞍踪|(zhì)合成增加是Ins/IGF-I→PI3K→PKB途徑和AMPK途徑的綜合結(jié)果,而且Ins/IGF-I→PI3K→PKB途徑占主導(dǎo)地位。綜上所述,花椒麻素對不同體質(zhì)(健康、糖尿病-Ⅰ型)大鼠個體的機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的影響及機(jī)制存在差異。對健康大鼠的影響主要是增加相對骨骼重量、降低腹脂率;增加血清和組織IGF-I含量(P0.05),而對Ins的影響不顯著(P0.05);促進(jìn)機(jī)體內(nèi)相應(yīng)α-酮酸的合成;并以IGF-I→PI3K→PKB信號途徑激活mTOR,而對氨基酸/氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的信號途徑和AMPK途徑的影響不顯著(P0.05)。對糖尿病大鼠的影響主要是增加相對骨骼重量;不僅顯著(P0.05)增加血清Ins含量,而且血清和組織中IGF-I含量同樣顯著(P0.05)增加;可激活A(yù)MPK途徑;糖尿病大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)是mTOR途徑和AMPK途徑的綜合結(jié)果,而且Ins/IGF-I→PI3K→PKB途徑占主導(dǎo)地位。雖然花椒麻素對不同體質(zhì)(健康試驗(yàn)SD大鼠,糖尿病試驗(yàn)大鼠)蛋白質(zhì)合成的信號途徑均為PI3K→PKB→mTOR。但兩者又存在差異,在健康SD大鼠體內(nèi),花椒麻素激活PI3K→PKB→mTOR途徑的信號因子為IGF-I;而在糖尿病試驗(yàn)大鼠機(jī)體內(nèi),花椒麻素激活這一信號途徑信號因子是Ins和IGF-I共同作用結(jié)果。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)可知,花椒麻素對健康SD試驗(yàn)大鼠主要體現(xiàn)為促進(jìn)蛋白質(zhì)合成;花椒麻素對糖尿病試驗(yàn)大鼠不僅促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,而且對機(jī)制蛋白質(zhì)分解具有抑制作用。通過以上研究,本文的創(chuàng)新點(diǎn)如下:(1)通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了花椒麻素可通過IGF-I→PI3K→PKB→mTOR途徑增加健康SD大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成。(2)通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了花椒麻素可激活糖尿病大鼠骨骼肌mTOR上游的Ins/IGF-I→PI3K→PKB途徑和AMPK途徑,并通過UPP途徑降低糖尿病大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)分解,機(jī)體蛋白質(zhì)的增加是合成與分解的最終結(jié)果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R151
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本文編號：1517562