發(fā)布時間：2018-02-10 18:02

  本文關(guān)鍵詞： 二-（4-氯苯甲酰異羥肟酸）二正丁基合錫（DBDCT） 神經(jīng)毒性 原子熒光光譜法（AFS） 毒代動力學 細胞凋亡 信號轉(zhuǎn)導通路　出處：《山西醫(yī)科大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：二-（4-氯苯甲酰異羥肟酸）二正丁基合錫（DBDCT）是一種典型的R2SnL2型有機錫類化合物，大量資料表明，此類有機錫化合物可致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，但具體機制不明，有待進一步研究。本實驗第一部分擬建立生物樣品中錫含量的檢測方法，，確定DBDCT毒代動力學參數(shù)，確定大鼠暴露于毒劑量DBDCT的組織分布，并證明DBDCT可以透過血腦屏障，從而對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響；第二部分及第三部分擬通過動物在體實驗和神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)兩條途徑研究DBDCT引起神經(jīng)毒性的作用，并對可能機制進行初步探討。 方法：（1）建立原子熒光光譜法（AFS）檢測血漿及組織勻漿中錫含量的方法，并采用AFS測定大鼠單次毒劑量（15mg/kg）靜脈注射DBDCT后的毒代動力學參數(shù)及組織分布，初步判斷DBDCT是否可以通過血腦屏障產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)影響；（2）采用紫外分光光度法測定大鼠多次靜脈注射DBDCT后的血清及腦組織生化指標；（3）觀察大鼠多次靜脈注射DBDCT前后體重的變化，并用HE染色檢測主要組織臟器的病理學改變，確定主要毒性靶器官和毒性產(chǎn)生的可能原因；（4）通過TUNEL和Westernblot技術(shù)，研究大鼠多次靜脈注射DBDCT后腦組織凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的表達情況，初步明確DBDCT產(chǎn)生神經(jīng)毒性的機制；（5）以PC12細胞為體外神經(jīng)毒性研究對象，采用MTT法測定染毒后細胞的增殖抑制率，通過光鏡、熒光染色和電鏡等方法觀察細胞核形態(tài)的變化，以PI/AnnexinV-FITC雙染檢測細胞染毒后的凋亡率，DNALadder方法檢測細胞染毒后凋亡的特異性條帶，用RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因的表達情況，從而證實DBDCT通過誘導細胞凋亡產(chǎn)生神經(jīng)毒性；（6）采用紫外分光光度法測定PC12細胞染毒前后caspase-3和caspase-9活性的變化；以流式細胞術(shù)測定線粒體跨膜電位（ΔΨm）及活性氧（ROS）的變化，通過Westernblot分析Bax、Bcl-2、Cyt-c、caspase-3、caspase-9、p-JNK及p-p38等蛋白表達，進一步確證DBDCT通過多個信號轉(zhuǎn)導通路誘導凋亡，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。 結(jié)果：（1）建立了定量準確，精密度高，操作方便的檢測血漿及組織勻漿中錫含量的AFS；測定了大鼠單次毒劑量靜脈注射DBDCT后毒代動力學參數(shù)：分布半衰期t1/2α為49.977min、消除半衰期t1/2β為1.260min、表觀分布容積Vc為8.201(μg/mL)/(mg/kg)、曲線下面積AUC為56.073(mg/kg)min、清除率Cl為0.297μg/mL/min/(mg/kg)；大鼠單次毒劑量靜脈注射后DBDCT可迅速分布到各組織，但錫濃度維持時間較短，腎上腺中錫濃度最高，其余組織中錫濃度相似，腦組織中能檢測到少量錫元素，注射后兩小時內(nèi)維持0.10μg/g以上水平；（2）大鼠多次靜脈注射DBDCT后，血清中AST、ALT、ALP、GGT、STB、BUN及CRE均顯著升高（p0.01），腦組織中SOD及GSH-Px顯著降低（p0.01），而MDA顯著增高（p0.01）；（3）大鼠多次靜脈注射DBDCT后，前三周體重雖有增加，但增長緩慢，最后一周稱重時體重不增反降，HE染色后光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，染毒組動物肝臟均被膜增厚，部分出現(xiàn)肝細胞嗜酸性變，核固縮等病理改變，部分腦組織也出現(xiàn)神經(jīng)細胞結(jié)節(jié)狀增生及皮質(zhì)部分神經(jīng)細胞變性等病理改變；（4）大鼠多次靜脈注射DBDCT后對腦組織進行TUNEL染色，光學顯微鏡下可見染毒組大鼠大腦皮質(zhì)中的細胞核大量呈現(xiàn)圓形和不規(guī)則形，棕染且著色深，凋亡指數(shù)AI極顯著增高，從8.26±1.25%增加到30.3±1.94%（p0.01），Westernblot實驗結(jié)果顯示染毒組蛋白Bax表達增加，蛋白Bcl-2的表達顯著減少，Bax/Bcl-2比值從0.767上升至2.842，且蛋白caspase-3及caspase-9均出現(xiàn)顯著地剪切條帶；（5）MTT法測定DBDCT暴露24h后PC12細胞IC50值為4.110μmol/L，通過光鏡、熒光染色和電鏡觀察到DBDCT染毒后PC12細胞呈現(xiàn)凋亡細胞所特有的形態(tài)學特征，PI/AnnexinV-FITC雙染顯示隨DBDCT染毒劑量的增大和暴露時間的延長，PC12細胞的凋亡率顯著增加（p0.05），瓊脂糖凝膠電泳中可見凋亡特征性改變的DNA梯形帶，RT-PCR實驗可見凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-8、caspase-9、NF-κB、Fas、Fas-L及Cty-c的表達均發(fā)生顯著變化（p0.05，p0.01）；（6）PC12細胞暴露于不同染毒劑量DBDCT不同時間后，caspase-3和caspase-9的活性顯著增加（p0.05，p0.01），隨著DBDCT染毒劑量的增加和暴露時間的延長，△Ψm顯著下降，ROS的生成明顯增多，蛋白Bcl-2的表達下凋，蛋白Bax表達上調(diào)，線粒體內(nèi)蛋白Cyt-c含量顯著下降，胞質(zhì)中蛋白Cyt-c含量明顯增加，蛋白caspase-3及caspase-9均出現(xiàn)越來越顯著地剪切條帶，p-JNK和p-p38的表達逐漸增加，且均有明顯量效和時效關(guān)系（p0.01）。 結(jié)論：（1）AFS適用于測定血液及組織樣品中錫的含量，大鼠單次靜脈注射DBDCT后血中錫濃度隨時間變化符合二室模型，分布迅速，錫濃度維持時間較短，在主要組織器官中不易蓄積，DBDCT可以透過血腦屏障，因此可能對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響；（2）DBDCT影響大鼠體重增長和一般生長發(fā)育，改變大鼠血清中多種生化指標，表現(xiàn)出顯著地肝臟及腎臟毒性；（3）DBDCT降低大鼠腦組織中抗氧化系統(tǒng)的活性，增強腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，一定程度上通過誘導細胞凋亡對大鼠腦組織神經(jīng)系統(tǒng)造成損害；（4）DBDCT能夠誘導體外培養(yǎng)的PC12細胞株發(fā)生凋亡，作用機制可能是氧化應(yīng)激及DNA損傷；Bcl-2家族、線粒體凋亡途徑及MAPK信號轉(zhuǎn)導通路均參與到DBDCT誘導的PC12細胞凋亡中，揭示DBDCT通過多途徑誘導神經(jīng)細胞凋亡從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R114

【參考文獻】

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1 石孝洪,魏世強,李軍;有機錫化合物的環(huán)境化學行為及效應(yīng)[J];重慶大學學報(自然科學版);2003年07期

2 周群芳,江桂斌;氣相色譜法在有機錫化合物形態(tài)分離與測定中的應(yīng)用[J];分析科學學報;2002年03期

3 王魯,莫寧;有機鍺藥理、毒理及應(yīng)用研究進展[J];廣西科學;1998年04期

4 徐福正,江桂斌,韓恒斌;氣相色譜與原子吸收聯(lián)用及其在有機錫化合物形態(tài)分析中的應(yīng)用[J];分析化學;1995年11期

5 商丹,張朝平;金屬抗癌藥物的研究現(xiàn)狀[J];貴州大學學報(自然科學版);2005年01期

6 李青山,田燕妮,楊頻,郭茂林,吳文士,萬嘉鑄;二正丁基錫(Ⅳ)-鄰菲咯啉-單核苷酸混配配合物的合成與表征[J];化學學報;1997年04期

7 梁淑軒,孫漢文;有機錫的環(huán)境污染及監(jiān)測方法研究進展[J];環(huán)境與健康雜志;2004年06期

8 尹富玲,申佳,鄒佳嘉,李榮昌;2,2′-聯(lián)吡啶和去甲基斑蝥酸根橋聯(lián)雙核銅(Ⅱ)配合物的合成、結(jié)構(gòu)表征及抗癌活性的研究[J];化學學報;2003年04期

9 黃志芳;急性有機錫中毒性腦病臨床分析[J];杭州醫(yī)學高等專科學校學報;2003年01期

10 郭麗萍,王堅,蔣雨平,宗鴻亮,王秋雁,郭鵬,顧建新;胰島素可抵抗MPP~+誘導的PC12細胞的凋亡[J];中國臨床神經(jīng)科學;2004年02期

本文編號：1501112