本文關(guān)鍵詞： 煤焦瀝青 炎癥 腫瘤壞死因子α 腫瘤相關(guān)巨噬細胞 NF-κB　出處：《鄭州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 眾多動物實驗及流行病學(xué)調(diào)查資料顯示,慢性炎癥與腫瘤發(fā)生之間存在因果關(guān)系。腫瘤相關(guān)巨噬細胞是存在于腫瘤微環(huán)境中的炎癥細胞,在腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移起重要作用。腫瘤壞死因子a(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)是由腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌、參與炎癥的重要細胞因子,可作為腫瘤的促進因子。核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-kappa B, NF-κB)是連接炎癥和癌癥的重要轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控細胞增殖、凋亡等相關(guān)基因,參與人類許多腫瘤發(fā)生。 TNFR--TRAD--RIP--TRAF2--IKK--NF-κB通路是激活NF-κB的通路之一。煤焦瀝青廣泛存在于工業(yè)生產(chǎn)中,是煉焦作業(yè)后產(chǎn)生的副產(chǎn)物,現(xiàn)已被國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)列為確切致癌物。目前,大多數(shù)研究著重于煤焦瀝青這一單獨因素引發(fā)肺癌機制,而關(guān)于炎癥在其致肺癌的過程中作用如何、機制如何報道較少,需要進一步的研究進行闡明清楚。 課題組前期工作：利用中溫煤焦瀝青煙提取物(Coal tar pitch Volatiles, CTPVs)為染毒物,作用于人支氣管上皮細胞(Human Bronchial Epithelial Cells, BEAS-2B)后,BEAS-2B細胞出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化；利用BEAS-2B細胞與巨噬細胞的前體人單核細胞系THP-1細胞共培養(yǎng),THP-1細胞可促進CTP誘導(dǎo)BEAS-2B細胞惡性轉(zhuǎn)化；且在細胞的惡性轉(zhuǎn)化中NF-κB p65蛋白及基因表達量升高。在課題組前期工作的基礎(chǔ)上,該研究欲從THP-1分泌細胞因子TNF-α以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TNFR--TRADD--RIP-TRAF2-IKK--NF-κB方面加以分析,探討炎癥促癌的可能機制,以期為煤焦瀝青所致職業(yè)性肺癌提供早期預(yù)防理論依據(jù)及肺癌早期診斷的生物標志。 方法 1檢測兩種培養(yǎng)方式的細胞上清TNF-α的表達水平：BEAS-2B細胞與THP-1細胞共培養(yǎng),兩細胞培養(yǎng)比列為10：1,經(jīng)CTP染毒；單獨培養(yǎng)的BEAS-2B細胞經(jīng)CTP染毒。收集共培養(yǎng)細胞及單獨培養(yǎng)的BEAS-2B細胞代謝液上清,利用ELISA方法檢測不同培養(yǎng)方式細胞上清液中細胞因子TNF-α的表達水平。 2檢測細胞的惡性轉(zhuǎn)化情況：共培養(yǎng)細胞培養(yǎng)至10代時分為3組：一組加入NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯(pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC),為PDTC組：一組細胞加入TNF-a中和抗體,為中和抗體組；一組細胞繼續(xù)培養(yǎng),為對照組。3組細胞同時常規(guī)傳代培養(yǎng)至20代,應(yīng)用流式細胞儀測定細胞周期、軟瓊脂集落形成實驗及染色體數(shù)目畸變分析檢測10代對照組、20代對照組、20代中和抗體組及20代PDTC組細胞惡性轉(zhuǎn)化指標。 3檢測基因及蛋白的表達情況：利用Western Blotting檢測10代對照組、20代對照組、20代中和抗體組及20代PDTC組細胞總蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor2, TRAF2)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表達水平及細胞胞核蛋白NF-κB p65的表達水平。利用RT-PCR分別檢測TRAF2、 CyclinD1、NF-κB p65mRNA的表達變化。 結(jié)果 1ELISA測定共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)BEAS-2B細胞代謝液中TNF-a表達水平：結(jié)果顯示共培養(yǎng)細胞較單獨培養(yǎng)細胞在10代、15代、20代、25代、30代時TNF-α的含量高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2細胞的惡性轉(zhuǎn)化情況： 2.1流式細胞儀測細胞周期：流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn),20代對照組細胞相比10代對照組細胞G1期細胞比例減少(P0.05),S期細胞所占比例增加,表明經(jīng)CTPVs染毒的細胞隨著細胞代數(shù)的增加其惡性程度隨之增加。20代中和抗體組與20代PDTC組細胞S期細胞所占比例分別相比與對照組細胞較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.2染色體數(shù)目畸變分析：實驗結(jié)果顯示,在10代對照組細胞中,染色體數(shù)目異常已經(jīng)顯現(xiàn)。20代對照組較10代對照組細胞非2倍體數(shù)目增多；20代中和抗體組、20代PDTC組細胞分別與20代對照組比較,染色體畸變率較低,非2倍體數(shù)目降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.0083)。 2.3軟瓊脂集落形成試驗：克隆形成以細胞數(shù)目超過50個為標準,10代對照組細胞形成克隆數(shù)在20個左右；20代對照組細胞形成大量克隆,惡性程度增高；20代中和抗體組以及20代PDTC組細胞克隆形成數(shù)目肉眼觀察明顯少于20代對照組；經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)：20代對照組與20代中和抗體組、20代PDTC組細胞相比差異分別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3基因及蛋白的表達情況： 3.1TRAF2、 CyclinD1、 NF-κBp65基因表達情況：分別對10代對照組、20代對照組、20代PDTC組及20代中和抗體組TRAF2、 CyclinD1、 NF-κB p65mRNA進行比較,結(jié)果顯示,20代對照組細胞NF-κB p65、 TRAF2、 CyclinDl mRNA相對表達量均高于10代對照組、PDTC組及中和抗體組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.2TRAF2、CyclinD1、 NF-κB p65蛋白表達情況：分別對10代對照組、20代對照組、20代PDTC組及20代中和抗體組TRAF2、 CyclinD1、NF-κB蛋白相對表達量進行比較,結(jié)果顯示,20代對照組胞核蛋白NF-κB p65、總蛋白TRAF2、 CyclinD1相對表達量均高于10代對照組、PDTC組及中和抗體組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 THP-1細胞加速煤焦瀝青煙氣提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細胞惡變過程中,THP-1可能通過分泌細胞因子TNF-α發(fā)揮作用；TNF-α與其受體相結(jié)合后可能通過TNFR--TRADD--R1P--TRAF2--IKK-NF-κB通路激活NF-κB,從而發(fā)揮促腫瘤的作用。
[Abstract]:background
Data in a number of animal experiments and epidemiological investigation showed that the causal relationship between chronic inflammation and cancer. Tumor associated macrophages in the tumor microenvironment in inflammatory cells in tumorigenesis, invasion and metastasis plays an important role. Tumor necrosis factor A (Tumor necrosis factor-A, TNF-a) is secreted by tumor associated macrophages, important cytokines are involved in inflammation, can be used as a tumor promoting factor. The nuclear transcription factor (Nuclear factor-kappa B, NF- K B) is an important transcription factor linking inflammation and cancer, can regulate cell proliferation, apoptosis related genes, involved in many human tumors.
TNFR--TRAD--RIP--TRAF2--IKK--NF-魏B閫氳礬鏄縺媧籒F-魏B鐨勯，

本文編號：1501160