本文關(guān)鍵詞： 煤焦瀝青 炎癥 腫瘤壞死因子α 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 NF-κB　出處：《鄭州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 眾多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)調(diào)查資料顯示,慢性炎癥與腫瘤發(fā)生之間存在因果關(guān)系。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是存在于腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞,在腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移起重要作用。腫瘤壞死因子a(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)是由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌、參與炎癥的重要細(xì)胞因子,可作為腫瘤的促進(jìn)因子。核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-kappa B, NF-κB)是連接炎癥和癌癥的重要轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)基因,參與人類許多腫瘤發(fā)生。 TNFR--TRAD--RIP--TRAF2--IKK--NF-κB通路是激活NF-κB的通路之一。煤焦瀝青廣泛存在于工業(yè)生產(chǎn)中,是煉焦作業(yè)后產(chǎn)生的副產(chǎn)物,現(xiàn)已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)列為確切致癌物。目前,大多數(shù)研究著重于煤焦瀝青這一單獨(dú)因素引發(fā)肺癌機(jī)制,而關(guān)于炎癥在其致肺癌的過(guò)程中作用如何、機(jī)制如何報(bào)道較少,需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行闡明清楚。 課題組前期工作：利用中溫煤焦瀝青煙提取物(Coal tar pitch Volatiles, CTPVs)為染毒物,作用于人支氣管上皮細(xì)胞(Human Bronchial Epithelial Cells, BEAS-2B)后,BEAS-2B細(xì)胞出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化；利用BEAS-2B細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的前體人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞共培養(yǎng),THP-1細(xì)胞可促進(jìn)CTP誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化；且在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中NF-κB p65蛋白及基因表達(dá)量升高。在課題組前期工作的基礎(chǔ)上,該研究欲從THP-1分泌細(xì)胞因子TNF-α以及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TNFR--TRADD--RIP-TRAF2-IKK--NF-κB方面加以分析,探討炎癥促癌的可能機(jī)制,以期為煤焦瀝青所致職業(yè)性肺癌提供早期預(yù)防理論依據(jù)及肺癌早期診斷的生物標(biāo)志。 方法 1檢測(cè)兩種培養(yǎng)方式的細(xì)胞上清TNF-α的表達(dá)水平：BEAS-2B細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng),兩細(xì)胞培養(yǎng)比列為10：1,經(jīng)CTP染毒；單獨(dú)培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)CTP染毒。收集共培養(yǎng)細(xì)胞及單獨(dú)培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞代謝液上清,利用ELISA方法檢測(cè)不同培養(yǎng)方式細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)水平。 2檢測(cè)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化情況：共培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)至10代時(shí)分為3組：一組加入NF-κB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯(pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC),為PDTC組：一組細(xì)胞加入TNF-a中和抗體,為中和抗體組；一組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),為對(duì)照組。3組細(xì)胞同時(shí)常規(guī)傳代培養(yǎng)至20代,應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)及染色體數(shù)目畸變分析檢測(cè)10代對(duì)照組、20代對(duì)照組、20代中和抗體組及20代PDTC組細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化指標(biāo)。 3檢測(cè)基因及蛋白的表達(dá)情況：利用Western Blotting檢測(cè)10代對(duì)照組、20代對(duì)照組、20代中和抗體組及20代PDTC組細(xì)胞總蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor2, TRAF2)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞胞核蛋白NF-κB p65的表達(dá)水平。利用RT-PCR分別檢測(cè)TRAF2、 CyclinD1、NF-κB p65mRNA的表達(dá)變化。 結(jié)果 1ELISA測(cè)定共培養(yǎng)及單獨(dú)培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞代謝液中TNF-a表達(dá)水平：結(jié)果顯示共培養(yǎng)細(xì)胞較單獨(dú)培養(yǎng)細(xì)胞在10代、15代、20代、25代、30代時(shí)TNF-α的含量高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化情況： 2.1流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),20代對(duì)照組細(xì)胞相比10代對(duì)照組細(xì)胞G1期細(xì)胞比例減少(P0.05),S期細(xì)胞所占比例增加,表明經(jīng)CTPVs染毒的細(xì)胞隨著細(xì)胞代數(shù)的增加其惡性程度隨之增加。20代中和抗體組與20代PDTC組細(xì)胞S期細(xì)胞所占比例分別相比與對(duì)照組細(xì)胞較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.2染色體數(shù)目畸變分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在10代對(duì)照組細(xì)胞中,染色體數(shù)目異常已經(jīng)顯現(xiàn)。20代對(duì)照組較10代對(duì)照組細(xì)胞非2倍體數(shù)目增多；20代中和抗體組、20代PDTC組細(xì)胞分別與20代對(duì)照組比較,染色體畸變率較低,非2倍體數(shù)目降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0083)。 2.3軟瓊脂集落形成試驗(yàn)：克隆形成以細(xì)胞數(shù)目超過(guò)50個(gè)為標(biāo)準(zhǔn),10代對(duì)照組細(xì)胞形成克隆數(shù)在20個(gè)左右；20代對(duì)照組細(xì)胞形成大量克隆,惡性程度增高；20代中和抗體組以及20代PDTC組細(xì)胞克隆形成數(shù)目肉眼觀察明顯少于20代對(duì)照組；經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)：20代對(duì)照組與20代中和抗體組、20代PDTC組細(xì)胞相比差異分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3基因及蛋白的表達(dá)情況： 3.1TRAF2、 CyclinD1、 NF-κBp65基因表達(dá)情況：分別對(duì)10代對(duì)照組、20代對(duì)照組、20代PDTC組及20代中和抗體組TRAF2、 CyclinD1、 NF-κB p65mRNA進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,20代對(duì)照組細(xì)胞NF-κB p65、 TRAF2、 CyclinDl mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于10代對(duì)照組、PDTC組及中和抗體組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.2TRAF2、CyclinD1、 NF-κB p65蛋白表達(dá)情況：分別對(duì)10代對(duì)照組、20代對(duì)照組、20代PDTC組及20代中和抗體組TRAF2、 CyclinD1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,20代對(duì)照組胞核蛋白NF-κB p65、總蛋白TRAF2、 CyclinD1相對(duì)表達(dá)量均高于10代對(duì)照組、PDTC組及中和抗體組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 THP-1細(xì)胞加速煤焦瀝青煙氣提取物誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡變過(guò)程中,THP-1可能通過(guò)分泌細(xì)胞因子TNF-α發(fā)揮作用；TNF-α與其受體相結(jié)合后可能通過(guò)TNFR--TRADD--R1P--TRAF2--IKK-NF-κB通路激活NF-κB,從而發(fā)揮促腫瘤的作用。
[Abstract]:background
Data in a number of animal experiments and epidemiological investigation showed that the causal relationship between chronic inflammation and cancer. Tumor associated macrophages in the tumor microenvironment in inflammatory cells in tumorigenesis, invasion and metastasis plays an important role. Tumor necrosis factor A (Tumor necrosis factor-A, TNF-a) is secreted by tumor associated macrophages, important cytokines are involved in inflammation, can be used as a tumor promoting factor. The nuclear transcription factor (Nuclear factor-kappa B, NF- K B) is an important transcription factor linking inflammation and cancer, can regulate cell proliferation, apoptosis related genes, involved in many human tumors.
TNFR--TRAD--RIP--TRAF2--IKK--NF-魏B閫氳礬鏄縺媧籒F-魏B鐨勯，

本文編號(hào)：1501160