本文關(guān)鍵詞： 香煙煙霧暴露 暴露生物標志 線粒體凋亡通路 組蛋白乙�；� miRNA　出處：《新疆醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:通過對香煙暴露生物標志物的測定,探討香煙在體內(nèi)的內(nèi)暴露水平;從分子生物學層面驗證吸煙對雄性大鼠生殖系統(tǒng)的毒性作用;探討表觀遺傳調(diào)控在吸煙所致雄性生殖毒性中的機制。方法:SD大鼠240只(雄性160只,雌性80只),隨機分為2、4、6、8、12周的低、中、高染毒劑量組及空白對照組。香煙暴露組按不同染毒劑量進行呼吸道靜式染毒,每日一次;空白對照組未進行香煙暴露處理。于不同時間點分別處死吸煙組和對照組大鼠,進行指標測定。香煙暴露組雄鼠于處死前1周分別與雌鼠(未染毒)按1∶1合籠交配,懷孕雌鼠自然分娩后連續(xù)觀察仔鼠生長發(fā)育情況21天后實驗結(jié)束。GC-MS/MS定量分析血漿中尼古丁、可替寧含量;HE染色觀察睪丸組織的結(jié)構(gòu)形態(tài);TUNEL法測定睪丸細胞凋亡情況;免疫組織化學法檢測各組大鼠睪丸Caspase-3活性;RT-PCR及Western Blot法測定線粒體凋亡通路中相關(guān)基因:Apaf-1、caspase-9、Bim、Bcl-w、Bak、及Ube2B的mRNA和蛋白的表達;計算各組大鼠的子代出生數(shù)及仔鼠的存活率和死亡率;測定大鼠睪丸組織中組蛋白乙酰化酶及組蛋白去乙�；傅幕钚�;運用mi RNA高通量芯片測序技術(shù)篩選香煙煙霧暴露后雄性大鼠睪丸組織miRNAs表達譜的改變情況,并對其靶基因進行預測。結(jié)果:(1)香煙暴露組大鼠出現(xiàn)張口喘息、流涎,腹式呼吸加劇,鼻噪音等癥狀;且染毒劑量越高,染毒周期越長,體重減少越明顯(P0.05);(2)不同暴露時間及暴露劑量間尼古丁含量的變化無統(tǒng)計學差異,且暴露時間與暴露劑量間無交互效應(yīng)(P0.05);(3)隨暴露時間的延長,暴露劑量的增加,大鼠血漿中可替寧含量較空白對照組(340±41.97 ng/ml)有所增加,不同暴露周期間可替寧含量的差異存在統(tǒng)計學差異(P0.05),且暴露時間與暴露劑量存在交互效應(yīng)(P0.05);(4)香煙暴露組大鼠隨染毒時間及劑量的增加,睪丸組織病理學改變也愈加明顯。12周起大鼠睪丸組織出現(xiàn)明顯的萎縮,大量細胞裂解,甚至在高劑量組中可見各級生精細胞完全消失,曲細精管空虛成網(wǎng)格狀分布。(5)隨暴露周期的延長,染毒組大鼠睪丸組織中逐漸出現(xiàn)TUNEL陽性染色,且12周組染色最為強烈;(6)香煙暴露組大鼠睪丸組織胞漿中含有caspase-3陽性細胞,陽性蛋白濃度于染毒第2周起逐漸增加(P0.05),染毒第6周起Caspase-3的蛋白表達總量顯著升高(p0.01);(7)香煙暴露組大鼠睪丸apaf-1基因的mrna和蛋白表達上調(diào),且不同暴露周期間apaf-1基因的mrna表達的差異有統(tǒng)計學意義(p0.01);與空白對照組相比,12周中、高劑量染毒組apaf-1基因mrna和蛋白表達的上調(diào)有顯著性差異(p0.05);(8)香煙暴露組大鼠睪丸capase-9基因的mrna和蛋白表達上調(diào),且不同暴露周期間capase-9基因mrna和蛋白表達的差異有統(tǒng)計學意義(p0.01);與空白對照組相比,12周中、高劑量染毒組capase-9基因mrna表達的上調(diào)有顯著性差異(p0.05),8周高劑量及12周中、高劑量染毒組睪丸capase-9蛋白表達的上調(diào)有統(tǒng)計學意義(p0.05);(9)香煙暴露組大鼠睪丸bim基因的mrna和蛋白表達上調(diào),且不同暴露周期間bim基因mrna表達的差異有統(tǒng)計學意義(p0.01),與空白對照組相比,12周低劑量染毒組bim基因mrna表達的上調(diào)有顯著性差異(p0.01);(10)香煙暴露初期,大鼠睪丸bak基因的mrna表達下調(diào),第8周起表達逐漸上調(diào),而bak的蛋白表達持續(xù)上調(diào),且不同暴露周期間bak蛋白表達的差異有統(tǒng)計學意義(p0.01);與空白對照組相比,12周高劑量組睪丸bak蛋白表達的上調(diào)有統(tǒng)計學意義(p0.05);(11)香煙暴露組大鼠睪丸bcl-w基因的mrna和蛋白表達下調(diào),不同暴露周期間bcl-w蛋白表達的差異有統(tǒng)計學意義(p0.01),且暴露時間與暴露劑量間存在交互效應(yīng)(p0.01);與空白對照組相比,6周、8周高劑量及12周各劑量組睪丸bcl-w蛋白表達的下調(diào)有統(tǒng)計學意義(p0.05);(12)香煙暴露初期,大鼠睪丸ube2b基因的mrna表達上調(diào),第8周起表達逐漸下調(diào),而ube2b的蛋白表達持續(xù)下調(diào),且不同暴露周期間ube2b蛋白表達的差異有統(tǒng)計學意義,與空白對照組相比,8周組中、高劑量染毒組和12周中、高劑量染毒組睪丸ube2b蛋白表達的下調(diào)呈現(xiàn)統(tǒng)計學差異(p0.05);(13)雄性大鼠的子代出生數(shù)隨香煙暴露時間及劑量的增加而減少,不同香煙暴露方式的仔鼠存活率有顯著性差異(p0.05);(14)香煙暴露組大鼠睪丸組蛋白乙�；�(hat)的活性升高,且不同暴露劑量間組蛋白乙酰化酶活性的差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);與空白對照組相比,8周高劑量、12周各劑量染毒組大鼠睪丸組蛋白乙酰化酶活性的增高有顯著性差異(p0.05);(15)香煙暴露組大鼠睪丸組蛋白去乙�；�(hdac)的活性降低,與空白對照組相比,6周高劑量以后各染毒組大鼠睪丸hdac活性的下降有統(tǒng)計學意義(p0.05);(16)吸煙大鼠睪丸組織mirna芯片篩選出5個差異性表達的mirnas,其預測的靶基因主要參與細胞凋亡正調(diào)節(jié)的生物學過程且明顯富集于細胞凋亡信號通路中。結(jié)論:大鼠血漿可替寧濃度能夠有效反映香煙煙霧內(nèi)暴露情況;香煙暴露可造成大鼠生殖系統(tǒng)損傷,其可能機制是吸煙激活了線粒體凋亡信號通路,從而導致睪丸組織不可逆性凋亡;吸煙可導致睪丸組織發(fā)生組蛋白乙�；揎椉癿irna特異性表達,提示表觀遺傳調(diào)控在吸煙所致大鼠生殖毒性損傷中起到重要作用。
[Abstract]:Objective : To study the effects of smoking on the reproductive system of male rats . The results showed that : ( 1 ) There was no significant difference between exposure time and exposure dose ( P0.05 ) . ( 1 ) Compared with the blank control group , there was a significant difference in the expression of bcl - 2 mRNA and protein in the testis of the exposed group ( p < 0.01 ) .

【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114
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本文編號：1491120