本文關(guān)鍵詞： 二硫化碳 胚胎植入 巨噬細(xì)胞極化 母胎界面 卵巢黃體　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景二硫化碳(Carbon disulfide,CS_2)是一種常用的粘膠纖維工業(yè)合成品原料,普遍應(yīng)用于服裝行業(yè)。服裝行業(yè)是一種以女性工作人員占主導(dǎo)的勞動密集型產(chǎn)業(yè)。近年來,CS_2對女性生殖系統(tǒng)的影響引起普遍關(guān)注。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),CS_2職業(yè)暴露的女性較非職業(yè)人群生殖系統(tǒng)方面會受到不同程度的損害。本課題組前期對職業(yè)女工的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),同對照組女性人群相比,CS_2暴露的職業(yè)女工人群表現(xiàn)出高的早早孕丟失以及受孕時(shí)間明顯延遲等特點(diǎn)。同時(shí),小鼠動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CS_2生殖毒性作用最為敏感的時(shí)期是胚胎植入期。由此可見,CS_2具有明顯的生殖毒性,并會影響胚胎植入,但其機(jī)制尚不清晰。母胎界面的免疫微環(huán)境保證了容受性子宮內(nèi)環(huán)境的建立,進(jìn)而利于植入和妊娠。巨噬細(xì)胞在母胎界面微環(huán)境的建立中起著至關(guān)重要的作用。在胚胎植入期,母胎界面巨噬細(xì)胞積聚于此,清除凋亡細(xì)胞,分泌細(xì)胞因子,誘導(dǎo)免疫耐受;同時(shí),分泌血管內(nèi)皮生長因子,促進(jìn)母胎界面血管的形成與重塑,構(gòu)建胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)奶ケP血管。此外,巨噬細(xì)胞參與卵巢黃體的形成,以保證正常雌、孕激素的分泌與運(yùn)輸。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),圍植入期暴露于CS_2可導(dǎo)致孕鼠子宮組織細(xì)胞炎性因子增多以及血清雌、孕激素水平下降,提示巨噬細(xì)胞與CS_2致小鼠胚胎植入障礙過程密切相關(guān)。綜上所述,植入期小鼠子宮和卵巢巨噬細(xì)胞極化和功能在CS_2暴露后發(fā)生改變可能是其胚胎植入障礙的重要機(jī)制之一。因此,本研究利用已經(jīng)構(gòu)建的小鼠胚胎植入障礙模型,在胚胎植入期不同時(shí)點(diǎn)暴露于二硫化碳后的不同時(shí)間斷面上,觀察小鼠卵巢和子宮組織中巨噬細(xì)胞極化和功能變化,以期揭示巨噬細(xì)胞極化和功能變化在二硫化碳致胚胎植入障礙中的作用。研究目的于小鼠受孕后植入期不同時(shí)間點(diǎn)暴露于CS_2建立小鼠胚胎植入障礙模型,檢測不同暴露點(diǎn)后不同觀察終點(diǎn)子宮組織中巨噬細(xì)胞極化變化,并測定相關(guān)因子IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β1以及Vegfa的表達(dá);同時(shí),檢測卵巢組織中巨噬細(xì)胞極化變化,并測定相關(guān)因子TNF-α、Cox2、Hif1-α和Vegfa的表達(dá),以期闡明巨噬細(xì)胞極化與功能改變在CS_2致小鼠胚胎植入障礙中的作用和機(jī)制。研究方法1.動物模型的建立性成熟昆明種小鼠(8-12w)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行合籠,雌雄合籠比例為1:1。次日早晨8點(diǎn)檢查雌性小鼠陰栓,以陰栓陽性者定義為懷孕第一天(GD1),并隨機(jī)分配到各組。模型共設(shè)3個(gè)染毒組(染毒時(shí)間點(diǎn)為GD3、GD4和GD5),并在各染毒時(shí)間點(diǎn)后的連續(xù)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置觀察終點(diǎn)(GD4、GD5、GD6和GD7,共計(jì)13個(gè)觀察終點(diǎn)),每個(gè)觀察終點(diǎn)含有12只孕鼠。染毒組以631.4mg/kg(0.4LD50)的劑量溶于橄欖油后進(jìn)行腹腔注射,對照組腹腔注射等體積的橄欖油作為溶劑對照。2.樣本收集與巨噬細(xì)胞極化與功能的檢測于各個(gè)觀察終點(diǎn)收集孕鼠子宮組織和卵巢組織。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測子宮內(nèi)膜組織巨噬細(xì)胞極化情況(F4/80:巨噬細(xì)胞;CD16/32:M1型巨噬細(xì)胞;CD206:M2型巨噬細(xì)胞)。應(yīng)用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測定全子宮組織中IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β1以及Vegfa蛋白和mRNA的表達(dá)水平。制備卵巢組織石蠟切片,HE染色后對卵巢中的黃體進(jìn)行病理分析,并對病理評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評分定量分析;同時(shí)采用免疫組化染色方法測定iNOS和Arg-1表達(dá)水平以檢測卵巢黃體M1、M2巨噬細(xì)胞含量并進(jìn)行定量分析。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定卵巢黃體中TNF-α、Cox2、Hif1-α以及VegfamRNA的表達(dá)水平。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入,并應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并以P0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將原始實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)除以對照組數(shù)據(jù),使原始數(shù)據(jù)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。測量指標(biāo)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),正態(tài)分布指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組比較之前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊,采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用Dunnett T test;若方差不齊,則選用Welch檢驗(yàn),兩兩比較采用Dunnett's T3 test。此外,應(yīng)用GraphPad Prism軟件繪制結(jié)果圖。研究結(jié)果1.CS_2暴露對卵巢黃體結(jié)構(gòu)與功能的影響圍植入期暴露于CS_2后,相比于對照組,孕鼠卵巢黃體結(jié)構(gòu)和功能受到不同程度的損傷。在GD4染毒GD5觀察終點(diǎn)上,孕鼠卵巢黃體血管明顯擴(kuò)張與充血(P0.05),卵巢結(jié)構(gòu)明顯受損(P0.05)。同時(shí),Cox2和Hif1-αmRNA測定結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞因子均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,其中Cox2細(xì)胞因子的mRNA在GD3染毒GD5觀察終點(diǎn)表達(dá)水平明顯升高(P0.05),而在GD5染毒GD7觀察終點(diǎn)表達(dá)水平明顯下降(P0.05);Hif1-α細(xì)胞因子的mRNA在GD3染毒GD4觀察終點(diǎn)、GD4染毒GD5觀察終點(diǎn)表達(dá)水平明顯升高(P0.05),然后降至正常水平。提示,CS_2暴露可導(dǎo)致孕鼠黃體損傷。2.CS_2暴露對卵巢黃體巨噬細(xì)胞極化平衡的影響相比于對照組,圍植入期GD3暴露組GD5觀察終點(diǎn)M1和M2巨噬細(xì)胞數(shù)量均明顯增加(M1:P0.05;M2:P0.01),隨后,M1型巨噬細(xì)胞降低至正常水平而M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量在GD6觀察終點(diǎn)明顯增加(P0.01)。同時(shí),M2型巨噬細(xì)胞在GD7觀察終點(diǎn)(GD4和GD5染毒)明顯下降(P0.05)。在植入窗口期,M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡由M1型巨噬細(xì)胞為主導(dǎo)(M1M2在GD3染毒GD4觀察終點(diǎn),P0.01)轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細(xì)胞為主導(dǎo)(M1M2在GD5染毒GD6觀察終點(diǎn),P0.01)。3.CS_2暴露對子宮內(nèi)膜組織巨噬細(xì)胞極化平衡的影響圍植入期GD3,GD4和GD5暴露于CS_2后,各觀察終點(diǎn)子宮內(nèi)膜M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組(在GD7觀察終點(diǎn)P0.01);但M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量于GD4染毒GD6觀察終點(diǎn)明顯升高(P0.05)。在植入窗口期,M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡由M1型為主導(dǎo)(GD3染毒GD4觀察終點(diǎn),P0.05)轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型為主導(dǎo)(GD3染毒GD5觀察終點(diǎn),P0.01),隨后又轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型為主(GD3染毒GD6和GD7觀察終點(diǎn))。4.CS_2暴露對子宮與卵巢組織免疫因子表達(dá)水平的影響圍植入期GD3暴露于CS_2后GD4觀察終點(diǎn),相比于對照組,子宮組織中IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05);而IL-12蛋白表達(dá)水平明顯下降(GD5,P0.01;GD7,P0.05)。另一方面,耐受因子的分泌變化紊亂,IL-10蛋白的表達(dá)水平在GD3染毒GD4觀察終點(diǎn)(P0.05)和GD4染毒GD7觀察終點(diǎn)(P0.01)明顯升高,但在GD5染毒GD6觀察終點(diǎn)上表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。TGF-β1蛋白表達(dá)水平在GD4和GD6觀察終點(diǎn)明顯升高(P0.05),其mRNA表達(dá)水平在GD7觀察終點(diǎn)明顯下降(P0.01)。卵巢組織中,TNF-αmRNA的表達(dá)水平明顯升高(GD3染毒GD4觀察終點(diǎn),P0.01;GD4染毒GD7觀察終點(diǎn),P0.01;GD5染毒GD6觀察終點(diǎn),P0.05)。5.CS_2暴露對子宮與卵巢組織血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平的影響相比于對照組,圍植入期GD3染毒暴露于CS_2后,子宮組織中VegfamRNA表達(dá)水平在GD4觀察終點(diǎn)明顯升高(P0.05)而在GD6觀察終點(diǎn)表達(dá)水平明顯下降(P0.05);Vegfa蛋白表達(dá)水平在GD5觀察終點(diǎn)明顯下降(P0.05)。卵巢組織中,VegfamRNA表達(dá)水平在GD4和GD7觀察終點(diǎn)上明顯升高(P0.01)。結(jié)論1.圍植入期CS_2染毒后,卵巢黃體和子宮內(nèi)膜組織M1/M2巨噬細(xì)胞極化平衡顯示為短時(shí)炎癥狀態(tài),提示巨噬細(xì)胞通過誘導(dǎo)耐受以調(diào)節(jié)炎癥不利于胚胎植入的狀態(tài)。2.圍植入期CS_2染毒后,卵巢黃體結(jié)構(gòu)和功能受損,這種受損的機(jī)制可能是由于巨噬細(xì)胞極化改變所致。3.圍植入期CS_2染毒后,子宮組織中耐受性因子IL-10以及TGF-β1蛋白表達(dá)水平升高,提示子宮組織旨在通過耐受性調(diào)節(jié)來保證剩余胚胎的正常植入和發(fā)育。
[Abstract]:鐮旂┒鑳屾櫙浜岀～鍖栫⒊(Carbon disulfide,CS_2)鏄竴縐嶅父鐢ㄧ殑綺樿兌綰ょ淮宸ヤ笟鍚堟垚鍝佸師鏂，

本文編號：1491565