發(fā)布時(shí)間：2018-02-02 22:49

  本文關(guān)鍵詞： 丙烯酰胺 神經(jīng)毒性 突觸素Ⅰ 可溶性N-甲基馬來(lái)酰胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE復(fù)合體) 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子　出處：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：丙烯酰胺(acrylamide, ACR)是一種水溶性的乙烯基單體,作為用途廣泛的化工原料其接觸主要包括職業(yè)和環(huán)境兩個(gè)方面：一般的職業(yè)接觸如市政供水處理、紙漿加工等；特殊的職業(yè)接觸主要指實(shí)驗(yàn)室的凝膠電泳操作。此外,一般人群因食用高溫油炸食品、吸煙、使用某些化妝品也會(huì)攝入一定量的ACR。由此,ACR所致健康危害因其毒效應(yīng)的“行業(yè)廣泛性”和“人群普遍性”而日益受到廣泛關(guān)注,但其致病機(jī)理至今尚未闡明。突觸素(synapsins)作為決定突觸可塑性變化的重要因素,其改變可較為準(zhǔn)確地反映突觸的分布和密度。本課題組前期研究表明,突觸素I(synapsin I)與ACR的神經(jīng)損傷效應(yīng)具有較強(qiáng)關(guān)聯(lián),synapsin I可能在ACR神經(jīng)損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophins, NTs)家族的重要成員,近年來(lái),有關(guān)BDNF的研究逐漸引起神經(jīng)領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。已有的研究提示：內(nèi)源性BDNF具有多方面的功能,既可聯(lián)系神經(jīng)元與刺激因素間的信號(hào)傳遞,也可介導(dǎo)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)元之間的交互調(diào)節(jié),對(duì)神經(jīng)突觸的形成和重塑具有重要意義,而外源性BDNF的效果尚不確切,外源性BDNF對(duì)ACR所致?lián)p傷的影響尚待闡明。 由此,在前期研究的基礎(chǔ)上,本文以突觸為ACR神經(jīng)損傷的物質(zhì)基礎(chǔ),以synapsin I為靶點(diǎn),研究不同層次(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞)ACR所致神經(jīng)毒效應(yīng)及可能的作用機(jī)制,以此為基礎(chǔ)開(kāi)展的BDNF機(jī)制針對(duì)性的干預(yù)研究可為防治ACR的神經(jīng)損傷提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。 1.丙烯酰胺神經(jīng)損傷動(dòng)物和細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)的建立 1.1神經(jīng)毒性動(dòng)物檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建 ACR腹腔注射(7.5、15、30mg/kg ACR)染毒雄雌性Wistar大鼠,每周6天,連續(xù)3周。觀察體重、神經(jīng)行為、組織病理等改變。結(jié)果表明,體重-時(shí)間變化趨勢(shì)可較為敏感地反映ACR的一般毒性,試驗(yàn)期間,染毒組大鼠體重增加減緩,30mg/kg ACR組接近染毒終點(diǎn)前體重進(jìn)入平臺(tái)期(雄性)或呈下降趨勢(shì)(雌性)。染毒后第2周末開(kāi)始,中毒體征日漸顯著,表現(xiàn)為進(jìn)食減少、拖步、肢體無(wú)力(雙后肢進(jìn)展到前肢)、腹側(cè)震顫、步態(tài)搖擺直至癱瘓：30mg/kg ACR組步態(tài)評(píng)分分值和熱覺(jué)指數(shù)增加。神經(jīng)病變明顯,病理檢查發(fā)現(xiàn)以小腦皮質(zhì)空泡變性、浦肯野細(xì)胞固縮為主,而神經(jīng)系統(tǒng)以外的重要組織器官如心、肝、肺、腎、脾、大腦、胃、腸、睪丸、附睪、卵巢、子宮等未見(jiàn)明顯病理學(xué)異常。5批次動(dòng)物染毒后的體重和神經(jīng)行為學(xué)參數(shù)的變化規(guī)律、病理病變部位、異常體征等未見(jiàn)顯著差異。 1.2神經(jīng)毒性細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建 以神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma, NB-1)細(xì)胞株為基礎(chǔ),采用終濃度為1mmol/1的雙丁�；h(huán)腺苷磷酸(dibutyryl cyclic AMP, db-cAMP)誘導(dǎo)處理10天。光鏡觀察細(xì)胞形態(tài),Western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá),甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測(cè)細(xì)胞存活情況并計(jì)算IC50。結(jié)果提示,誘導(dǎo)10天后細(xì)胞間突觸結(jié)構(gòu)清晰,神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase, NSE)鑒定顯示明確的神經(jīng)元特性：synapsin I表達(dá)顯著且趨于穩(wěn)定,由此,構(gòu)建分化成熟的神經(jīng)元體系。ACR對(duì)誘導(dǎo)成熟后NB-1細(xì)胞的IC50為69.8μg/l(48小時(shí))。結(jié)合MTT和LDH結(jié)果分析,設(shè)定進(jìn)一步機(jī)制研究中ACR的系列染毒劑量為40、80和100μg/1,染毒48小時(shí)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和終止時(shí)細(xì)胞特性相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果未見(jiàn)顯著差異。 本研究所制備的ACR神經(jīng)損傷動(dòng)物和細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)的基本特點(diǎn)為：染毒集中、相對(duì)穩(wěn)定、神經(jīng)毒性針對(duì)性較強(qiáng),可基本滿足后續(xù)研究的需要。 2.丙烯酰胺神經(jīng)損傷的突觸素I靶點(diǎn)效應(yīng)機(jī)制研究 2.1丙烯酰胺所致神經(jīng)突觸損傷效應(yīng) 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平探討ACR對(duì)神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性的影響。電鏡檢測(cè)突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化；免疫組化和Western-blot法相結(jié)合反映突觸特異位點(diǎn)synapsin I的定性、定位、定量變化。結(jié)果提示,與對(duì)照組比較,30mg/kg ACR組大鼠的突觸活性帶長(zhǎng)度顯著縮短(P0.05),synapsin I的定位無(wú)明顯變化,均位于脊髓背角灰質(zhì)神經(jīng)纖維末梢：對(duì)照組synapsin I著色較深,呈強(qiáng)陽(yáng)性,隨染毒劑量增加陽(yáng)性信號(hào)漸減弱,30mg/kg ACR組synapsin I蛋白含量較對(duì)照顯著降低(P0.05)。 在突觸可塑性變化的基礎(chǔ)上,從神經(jīng)沖動(dòng)動(dòng)態(tài)傳導(dǎo)的角度探討下游神經(jīng)元的繼發(fā)損傷效應(yīng)。電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化；定磷法測(cè)定背根神經(jīng)節(jié)中ATP酶的活性。結(jié)果提示,細(xì)胞器損傷及神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂,隨染毒劑量增加,ATP酶活性降低。 可見(jiàn),ACR損傷神經(jīng)突觸,表現(xiàn)為突觸的結(jié)構(gòu)和功能異常；神經(jīng)突觸損傷繼發(fā)下游神經(jīng)細(xì)胞損傷效應(yīng)；synapsin I是ACR所致突觸可塑性損傷的重要因子,在功能可塑性中發(fā)揮重要作用,可能是ACR神經(jīng)損傷的重要靶點(diǎn)之一,成為機(jī)制研究的重要線索。 2.2突觸素I與SNARE復(fù)合體在丙烯酰胺神經(jīng)損傷中的相關(guān)變化 在細(xì)胞水平探討ACR神經(jīng)損傷過(guò)程中,synapsin I與SNARE復(fù)合體(可溶性N-甲基馬來(lái)酰胺敏感因子附著蛋白受體soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor proteins, SNAREs包括syntaxin、SNAP-25、VAMP)的關(guān)聯(lián)。siRNA下調(diào)synapsin I蛋白后,Western-blot進(jìn)行SNAREs目關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果提示,ACR所造成的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)損傷明顯,突觸結(jié)構(gòu)破壞,synapsinI蛋白水平顯著降低(P0.05)。siRNA下調(diào)靶點(diǎn)蛋白synapsin I后再對(duì)細(xì)胞給予40μg/l ACR染毒處理,SNAP-25蛋白表達(dá)增加,與對(duì)照比較差異有顯著性(P0.05),VAMP和syntaxin變化不顯著(P0.05)。 3.丙烯酰胺神經(jīng)損傷的靶點(diǎn)干預(yù)研究 3.1BDNF干預(yù)效應(yīng)的體外研究 在體外試驗(yàn)條件下探討不同劑量BDNF(50、75和100ng/ml)對(duì)ACR所致神經(jīng)損傷的影響。光鏡形態(tài)學(xué)觀察；MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率；Western-blot檢測(cè)synapsin I蛋白表達(dá)。結(jié)果提示,染毒后細(xì)胞形態(tài)和突觸結(jié)構(gòu)損傷明確；50和75ng/mlBDNF干預(yù)可減輕ACR的細(xì)胞毒性,細(xì)胞相對(duì)存活率較60μg/l ACR單獨(dú)染毒組顯著增加(P0.05)；BDNF劑量增加到一定水平(100ng/ml),干預(yù)效果減弱,細(xì)胞相對(duì)存活率與60μg/l ACR組比較差異不顯著(P0.05)。ACR染毒致胞內(nèi)Ca2+濃度增加,BDNF在一定劑量范圍內(nèi)(50-75ng/ml)可對(duì)抗胞內(nèi)Ca2+超載,胞內(nèi)Ca2+濃度較60μg/l ACR染毒組降低(P0.05)；當(dāng)BDNF達(dá)到較高劑量時(shí)(100ng/ml),該干預(yù)效應(yīng)減弱,與60μg/l ACR組比較差異不顯著(P0.05)。50-75ng/mlBDNF干預(yù)可對(duì)神經(jīng)突觸發(fā)揮一定保護(hù)作用,synapsin I蛋白含量顯著高于60lg/l ACR染毒組(P0.05); BDNF劑量增加到一定水平(100ng/ml)時(shí),synapsin I表達(dá)量降低,與60μg/l ACR組比較差異不顯著(P0.05)�？梢�(jiàn),BDNF在適宜劑量范圍內(nèi)(50-75ng/ml)對(duì)ACR所致神經(jīng)損傷具有一定的干預(yù)效果,可能是其對(duì)抗胞內(nèi)鈣超載,上調(diào)特異位點(diǎn)synapsin I蛋白含量,促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放,維持突觸結(jié)構(gòu)的完整。 3.2BDNF干預(yù)效應(yīng)的體內(nèi)研究 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件下探討B(tài)DNF對(duì)ACR所致神經(jīng)損傷的干預(yù)效應(yīng)。雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組(生理鹽水)、干預(yù)劑對(duì)照組(48μg/kgBDNF)、ACR染毒組(30mg/kgACR)和低、中、高劑量BDNF (3、12、48μg/kgBDNF)干預(yù)組。ACR腹腔注射(30mg/kg ACR)染毒,每周6天,連續(xù)3周,對(duì)照組給予生理鹽水。BDNF自第2周初在30mg/kg ACR腹腔注射前10分鐘尾靜脈注射給藥,隔日1次,直至ACR染毒結(jié)束時(shí)止,首次劑量加倍；干預(yù)劑對(duì)照組除無(wú)染毒因素外與高劑量干預(yù)組操作一致。步態(tài)評(píng)分和后肢撐力距離測(cè)定評(píng)價(jià)神經(jīng)行為異常；檢測(cè)腦分區(qū)、脊髓、坐骨神經(jīng)等組織的超微結(jié)構(gòu)；ELISA法檢測(cè)外周血(血漿、血清)、神經(jīng)組織(中樞、周圍)中BDNF的含量；Western-blot檢測(cè)synapsin I蛋白表達(dá)。結(jié)果提示,與30mg/kgACR染毒組比較,高劑量BDNF干預(yù)組對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠具有一定的保護(hù)作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),高劑量(48μg/kgBDNF)干預(yù)組大鼠體重高于30mg/kgACR染毒組,異常體征弱于ACR染毒組,步態(tài)評(píng)分和后肢撐力距離低于ACR染毒組(P0.05)。ACR染毒不同時(shí)點(diǎn)時(shí)血漿、血清、中樞神經(jīng)(腦)BDNF的變化趨勢(shì)較為一致,均為染毒初期短暫增加后逐漸降低；而周圍神經(jīng)(坐骨神經(jīng))BDNF染毒初期短暫降低后出現(xiàn)波動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),染毒組與各劑量干預(yù)組血漿BDNF含量均較對(duì)照顯著降低(P0.05),高劑量BDNF干預(yù)組顯著高于30mg/kg ACR染毒組(P0.05)。 結(jié)論：ACR引起神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能損傷,synapsin I是損傷作用的關(guān)鍵效能因子,synapsin I影響SNAREs的蛋白表達(dá),其中SNAP-25的變化最為顯著,可能對(duì)SNAREs的形成和解離發(fā)揮一定影響,在ACR所致突觸損傷中發(fā)揮重要作用；適當(dāng)劑量的BDNF (50-75ng/ml)對(duì)ACR誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷具有一定的干預(yù)效果,可能機(jī)制在于對(duì)抗胞內(nèi)鈣超載,上調(diào)synapsin I蛋白水平,促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放,維持突觸結(jié)構(gòu)的完整。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1485675