本文關(guān)鍵詞： 三氯乙烯 三氯乙烯藥疹樣皮炎 二氯乙酰氯 HLA-B~*1301 動物模型 人類白細(xì)胞抗原　出處：《中國疾病預(yù)防控制中心》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：三氯乙烯(CHCl=CCl2,Trichloroethylene,TCE),是二碳有機(jī)氯溶劑中溶解力最強(qiáng)的一種,由于其卓越的性能廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活各個領(lǐng)域。在TCE的生產(chǎn)和使用過程均有可能造成作業(yè)工人的健康損害。據(jù)統(tǒng)計(jì),1993-2008年深圳市龍崗區(qū)發(fā)生職業(yè)中毒事故94宗,造成430人中毒,10人死亡,直接經(jīng)濟(jì)損失近4000萬元,發(fā)病關(guān)聯(lián)程度最大的是TCE。深圳寶安區(qū)1993-2002年調(diào)查資料顯示,10年間全區(qū)共診斷各種職業(yè)病和職業(yè)中毒232例,有機(jī)溶劑職業(yè)中毒占90.1%,應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)分析法對職業(yè)病發(fā)展勢態(tài)進(jìn)行量化比較分析發(fā)現(xiàn),與職業(yè)病發(fā)病總數(shù)關(guān)聯(lián)程度最大也是TCE。1990～2005年,深圳市共發(fā)生職業(yè)病人數(shù)896人,其中死亡40人,死亡病例主要為三氯乙烯藥疹樣皮炎(dermatitis medicamentosa-like of Trichloroethylene,DMLT)患者(構(gòu)成比為50.0%)。深圳寶安區(qū)2006年調(diào)查資料顯示,治愈1例DMLT平均經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)約8萬元人民幣,而死亡1例經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)約28萬元人民幣。為減少此類經(jīng)濟(jì)損失,職業(yè)危害的一級和二級預(yù)防顯得尤為重要。易感性生物標(biāo)志物可用以篩檢易感人群,保護(hù)高危人群,節(jié)約社會資源。在TCE暴露人群中開展生物標(biāo)志物研究,對TCE暴露的危險度評價,探索TCE的致病機(jī)制,保護(hù)易感人群具有重要意義。 本研究包括以下兩個方面,第一,在人群中驗(yàn)證HLA-B81301等位基因作為DMLT易感性生物標(biāo)志物的有效性；第二是探索DMLT動物模型的構(gòu)建,為機(jī)制研究提供線索。 一.HLA-B*1301等位基因作為DMLT易感性生物標(biāo)志物的有效性驗(yàn)證 本研究建立了1764人的隊(duì)列。對深圳市19個街道共204家工廠進(jìn)行問卷調(diào)查和采樣,符合條件的工人共有1651人,男性948人(57.4%),女性703人(42.6%),年齡范圍17～58歲(平均27.03歲)。采樣結(jié)束后進(jìn)行電話隨訪,全部研究對象隨訪時間90d,隨訪率93.6%。 基因分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)1651人中HLA-B*1301(+)158人(9.57%),發(fā)病12人(7.59%), HLA-B*1301(-)1493人(90.43%),發(fā)病4人(0.27%)。HLA-B*1301陽性的工人發(fā)病率顯著高于HLA-B*1301陰性的工人(RR:28.35;95%CI:9.25-86.85),歸因危險度百分比達(dá)96.44%,說明HLA-B*1301等位基因是DMLT發(fā)病的主要因素,充分驗(yàn)證了前期病例對照研究的結(jié)果。調(diào)整其他混雜因素之后應(yīng)用多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),暴露類型(OR:8.88;95%CI:2.21-35.63)和HLA-B*1301基因型(OR:20.17;95%CI:5.74-70.58)是影響DMLT發(fā)病率的主要因素。因此,在就業(yè)前體檢中進(jìn)行HLA-B*1301等位基因篩查是減少DMLT發(fā)病的有效措施。受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析結(jié)果表明,由于其陰性預(yù)測值為99.7%,HLA-B*1301等位基因檢測特別適合于就業(yè)前篩查。假設(shè)就業(yè)前所有工人都進(jìn)行HLA-B*1301基因篩查,阻止一例DMLT發(fā)病的NNS(為預(yù)防和治療一次不良結(jié)果事件所需篩檢的病人數(shù),the number of people needed to screen in order to prevent/treatment an adverse outcome, NNS)為143,同時也說明在一般人群中篩查,HLA-B*1301基因是一個非常有效的易感性標(biāo)志物。篩查143各工人的直接成本是7150元人民幣,這遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于一例發(fā)病者的治療和護(hù)理費(fèi)用(32043～64540元人民幣)。該結(jié)果可以為早期預(yù)防措施的選擇提供參考。 二.DMLT動物模型的構(gòu)建 1.TCE與二氯乙酰氯(dichloroacetyl chloride, DCAC)的致敏性研究 分別以豚鼠、BALB/c小鼠、MRL/lrp小鼠為實(shí)驗(yàn)對象,參照OECD (406)皮膚變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行三次誘導(dǎo)和一次激發(fā),末次激發(fā)后24h,取血制備血清；取肝右葉10%福爾馬林固定；取約3×3mm肝組織液氮凍存,留提RNA；余下肝組織和脾分別加入組織勻漿液勻漿,取上清檢測細(xì)胞因子。結(jié)果顯示,DCAC可引起72.7%的豚鼠皮膚出現(xiàn)紅斑反應(yīng),根據(jù)Magnusson致敏強(qiáng)度分類為強(qiáng)度致敏物。BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠在致敏過程中,未觀察到明顯的過敏反應(yīng)。激發(fā)的同時以激發(fā)濃度涂抹小鼠耳廓,也未觀察到耳廓腫脹。激發(fā)后豚鼠皮膚出現(xiàn)明顯的紅斑和水腫,皮膚病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),TCE和DCAC組豚鼠皮膚炎癥細(xì)胞浸潤真皮內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張、水腫,變應(yīng)性反應(yīng)明顯。BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠皮膚未觀察到異常反應(yīng)。轉(zhuǎn)氨酶的檢測結(jié)果顯示豚鼠、BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠的TCE組轉(zhuǎn)氨酶均無明顯變化,豚鼠和BALB/c小鼠的DCAC組轉(zhuǎn)氨酶輕度升高,P值分別為0.053和0.079。肝組織病理結(jié)果表明受試物組未出現(xiàn)明顯異常。 分別檢測三種動物的血清、肝組織勻漿和脾組織勻漿液中IL-2、IL-4、IL-5、 IL-10、IL-12、IFN-γ、 GM-CSF和TNF-α八種細(xì)胞因子,結(jié)果顯示,IL-2和IFN-γ表達(dá)水平TCE組低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。其他六種細(xì)胞因子在對照組、TCE組和DCAC組的比較中差異均無顯著性。血清組IL-4和GM-CSF的表達(dá)顯著高于肝勻漿組和脾勻漿組(p0.05)；肝勻漿組中IL-2、IL-12、 IFN-γ TNF-α水平高于血清組和脾勻漿組(p0.05),GM-CSF高于脾勻漿組但低于血清組(p0.05)；脾勻漿組的IL-5和IL-10高于肝勻漿組和血清組(p0.05)。 據(jù)以上結(jié)果可以看出,應(yīng)用該實(shí)驗(yàn)方法未能誘導(dǎo)出接近于DMLT的動物模型。但本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCAC為強(qiáng)致敏物,有可能導(dǎo)致豚鼠和BALB/c、鼠出現(xiàn)肝損傷；并且提示,使用橄欖油溶解TCE和DCAC,采用OECD (406)皮膚變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過程,不能使BALB/c小鼠、MRL/lrp小鼠出現(xiàn)明顯的過敏反應(yīng),這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于今后的研究有一定參考價值。 由于TCE的體內(nèi)代謝過程較為復(fù)雜,進(jìn)入機(jī)體后,TCE或其代謝產(chǎn)物可能需要與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)之后形成完全抗原才能被抗原提呈細(xì)胞提呈,進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答�；蛘逿CE及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)與內(nèi)源性蛋白(如熱休克蛋白等)結(jié)合形成超抗原,并在接觸TCE的同時,體內(nèi)存在病毒感染、短小棒狀桿菌等生物性佐劑分子,致使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。由此,根據(jù)過繼免疫的原理,將TCE和DCAC誘導(dǎo)過的實(shí)驗(yàn)動物取樣,將所取生物樣品導(dǎo)入新的實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi),觀察實(shí)驗(yàn)動物是否出現(xiàn)致敏反應(yīng)。 2.免疫過繼實(shí)驗(yàn)構(gòu)建TCE藥疹樣動物模型 將SPF級BALB/c小鼠分兩組,一組按照致敏過程每隔二天誘導(dǎo)接觸TCE一次,另一組為溶劑對照。連續(xù)誘導(dǎo)3次,末次誘導(dǎo)后14h,取血制備血清,取肝、脾、腎分別制備三種組織勻漿。同時取擴(kuò)增的人表皮細(xì)胞,一組直接用福爾馬林殺死細(xì)胞,無菌生理鹽水洗3次并調(diào)濃度為1.67x105/L,另一組以10mmol/L濃度TCE共培養(yǎng)24h后,用福爾馬林殺死細(xì)胞,無菌生理鹽水洗3次并調(diào)濃度為1.67x105/L。將以上所制備的血清(+／-)、肝組織勻漿(+／-)、脾組織勻漿(+／-)、腎組織勻漿(+／-)和人表皮細(xì)胞(+／-)作為過繼免疫的受試物,轉(zhuǎn)輸?shù)绞荏w小鼠體內(nèi),觀察動物反應(yīng)。 結(jié)果顯示,小鼠皮下注射各組織勻漿液后24h,細(xì)胞組、血清組、腎組、脾組和對照組小鼠均無異常表現(xiàn),毛順滑,活躍,個別腹部有未吸收完全的皮丘。肝組小鼠(TCE-/+)多數(shù)被毛蓬松,活動減弱,呼吸頻率增高,成疾病狀態(tài),腹部皮丘多未吸收。注射96h后,各組動物毛順滑,活躍,表現(xiàn)良好。腎組個別動物腹部注射處出現(xiàn)微小丘狀硬結(jié),肝組動物腹側(cè)有明顯丘狀硬結(jié),為未吸收的組織勻漿形成肉芽腫樣結(jié)節(jié)。激發(fā)后,耳廓涂抹未見明顯反應(yīng)。足跖腫脹明顯,經(jīng)多變量方差分析后發(fā)現(xiàn),各組數(shù)據(jù)在0h、24h、48h、72h、96h五個時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析顯示,陽性對照組(DNCB)與其余各組之間差異均有顯著性意義(p0.01),陰性對照組(NS)與肝勻漿組、脾勻漿組、腎勻漿組、血清組和細(xì)胞組之間差異均無顯著性意義(p0.05),各組中TCE(-)和TCE(+)之間差異也無顯著性意義(p0.05)。說明經(jīng)過TCE誘導(dǎo)的組織勻漿和表皮細(xì)胞與未經(jīng)過TCE誘導(dǎo)的組織勻漿和表皮細(xì)胞對造成小鼠足跖腫脹之間的差異無顯著性意義。 動物模型構(gòu)建過程中,動物遺傳特點(diǎn)、給藥途徑、免疫狀態(tài)、受試物本身及其代謝產(chǎn)物、復(fù)合物形成等因素均影響目標(biāo)表型的產(chǎn)生。也有研究發(fā)現(xiàn),物種、品系、性別因素對TCE的吸收分布代謝過程影響很大,從而影響TCE的毒作用表現(xiàn)。那么,今后的模型構(gòu)建研究中,嘗試使用不同溶劑溶解,構(gòu)建TCE及其代謝產(chǎn)物的復(fù)合抗原,選擇對TCE代謝速率較慢的實(shí)驗(yàn)動物作為模型動物或許會出現(xiàn)新的突破。 綜上所述,本研究建立職業(yè)暴露隊(duì)列,首次得出DMLT在職業(yè)暴露人群中的總發(fā)病率為0.91%。充分驗(yàn)證了前期病例對照研究的結(jié)果,證實(shí)攜帶HLA-B*1301基因型是TCE作業(yè)工人藥疹樣皮炎發(fā)病的主要暴露因素這一病因假說。并進(jìn)行了HLA-B1301基因型作為DMLT易感性生物標(biāo)志物初步的成本效果分析,為HLA-B*1301等位基因作為易感性生物標(biāo)志物應(yīng)用于就業(yè)前基因篩查提供有價值的資料。為探索DMLT的發(fā)病機(jī)制,本研究利用BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠構(gòu)建動物模型,未達(dá)到滿意的效果,但所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為以后的研究提供有價值的信息。
[Abstract]:According to the survey data from 1993 to 2002 in Baoan District , Shenzhen Bao ' an area , there were 896 people who died of occupational diseases and occupational poisoning . The study included the following two aspects : First , the efficacy of HLA - B81301 allele as a biomarker of DMLT was verified in the population ; and the second was to explore the establishment of DMLT animal model and provide clues for the mechanism study . I . Validation of HLA - B * 1301 allele as a biomarker of DMLT susceptibility The study established 1764 people ' s queue . The survey and sampling were conducted for 204 factories in 19 streets in Shenzhen . The eligible workers were 1651 , male 948 ( 57.4 % ) , female 703 ( 42.6 % ) , age ranged from 17 to 58 years ( mean 27.03 years ) . After the end of sampling , telephone follow - up was conducted . The follow - up time of all study subjects was 90d and the follow - up rate was 93.6 % . The results showed that HLA - B * 1301 allele was the main factor to reduce the incidence of DMLT . The results showed that HLA - B * 1301 allele was the main factor to reduce the incidence of DMLT . II . Construction of DMLT Animal Model Study on the Sensitization of TCE and dichloroacetyl chloride ( DCAC ) In BALB / c mice and MRL / lpr mice , no obvious allergic reaction was observed in BALB / c mice and MRL / lpr mice . The levels of IL - 2 , IL - 4 , IL - 5 , IL - 10 , IL - 12 , IL - 5 , IL - 10 , IL - 12 , IFN - 緯 , GM - CSF and TNF - 偽 in serum of three kinds of animals were significantly higher than those in control group ( p < 0.05 ) . It can be seen from the above results that the experimental method failed to induce the animal model close to DMLT . However , it was found that DCAC was a strong sensitizer , which could lead to liver injury in guinea pigs and BALB / c mice . It was suggested that using olive oil to dissolve TCE and DCAC could not induce obvious allergic reactions in BALB / c mice and MRL / lrp mice . After entering the organism , TCE or its metabolites may need to be coupled with the protein carrier to form the superantigen after entering the organism , thus inducing the organism to generate immune response . 2 . Establishment of an Animal Model of TCE Drug eruption by Immune - adoptive Experiment The serum ( + / - ) , liver tissue homogenate ( + / - ) , spleen tissue homogenate ( + / - ) , renal tissue homogenate ( + / - ) and human epidermal cells ( + / - ) were treated with formalin . The results showed that there was no significant difference between the two groups ( P < 0.05 ) . After 96 hours of injection , there was no significant difference between the two groups ( P < 0.05 ) . The results showed that there was no significant difference between the two groups ( P < 0.05 ) . In the process of animal model construction , animal genetic characteristics , administration route , immune status , test article itself and its metabolites , complex formation , etc . all affect the production of target phenotype . In conclusion , this study establishes occupational exposure cohorts , and the overall incidence rate of DMLT in occupational exposure population is 0.91 % . The results of early case - control studies have been fully validated . It is confirmed that HLA - B * 1301 genotype is the main exposure factor for the pathogenesis of drug eruption dermatitis in TCE workers .

【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R135.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1485308