本文關(guān)鍵詞： 錳 線粒體自噬 SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞 FOXO3 神經(jīng)毒性　出處：《首都醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：錳廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中如采礦業(yè)、金屬冶煉、焊接等領(lǐng)域;同時(shí)由于含錳防爆劑甲基環(huán)戊二烯三羰基錳(Methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl,MMT)代替四乙基鉛廣泛使用,造成環(huán)境中過(guò)量錳暴露,對(duì)人體健康造成危害。錳化合物顆粒主要通過(guò)呼吸道進(jìn)入人體,極易分布在富含線粒體的組織。腦排出速率較其它器官慢,吸收過(guò)量的錳化合物主要引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變,表現(xiàn)為帕金森樣癥狀。線粒體是為機(jī)體提供能量的主要場(chǎng)所,錳對(duì)線粒體有特殊親和力,可通過(guò)阻斷線粒體能量轉(zhuǎn)換、增加自由基產(chǎn)量影響線粒體功能,阻礙細(xì)胞呼吸,導(dǎo)致線粒體膜電位降低,活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生增加,線粒體損傷。隨著對(duì)帕金森疾病研究的不斷深入,已有研究證明線粒體損傷是錳引起帕金森疾病的重要機(jī)制之一。線粒體自噬作為線粒體質(zhì)量控制的首要過(guò)程,參與MnCl_2致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞自噬。有文獻(xiàn)報(bào)道,轉(zhuǎn)錄因子FOXO3調(diào)控線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá),但其是否參與MnCl_2致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞線粒體自噬過(guò)程及其可能的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究利用MnCl_2染毒具有多巴胺能神經(jīng)元特性的細(xì)胞系神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y),確定MnCl_2最適染毒劑量,在250μM MnCl_2染毒下觀察不同時(shí)間的線粒體自噬發(fā)生情況;并通過(guò)檢測(cè)線粒體功能指標(biāo)如線粒體膜電位、線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)量;通過(guò)慢病毒si RNA沉默F(xiàn)OXO3基因(si FOXO3)實(shí)現(xiàn)FOXO3低表達(dá),探討FOXO3在線粒體自噬發(fā)生中的分子機(jī)制。1.MnCl_2致SH-SY5Y細(xì)胞毒性的劑量效應(yīng)關(guān)系將SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞分別暴露于250、500、1000μM MnCl_2染毒24 h,通過(guò)MTT法檢測(cè)MnCl_2對(duì)細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果表明,隨著染毒濃度的增加,細(xì)胞存活率呈明顯的下降趨勢(shì)。于250μM MnCl_2處細(xì)胞存活率為84.3%±2.2%。各染毒組細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.MnCl_2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系將SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞暴露于250μM MnCl_2分別染毒2、4、6、8、12、24 h,通過(guò)MTT法檢測(cè)MnCl_2對(duì)細(xì)胞的時(shí)間毒性作用。結(jié)果表明,隨著染毒時(shí)間的增加,細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)。6 h處細(xì)胞存活率為82±3%,12 h細(xì)胞存活率80%,實(shí)驗(yàn)組(除2 h外)細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.MnCl_2致SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬線粒體自噬是清除受損線粒體的有效途徑之一,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TEM、激光共聚焦線粒體和溶酶體共定位及蛋白印記檢測(cè)線粒體自噬相關(guān)蛋白。結(jié)果可見(jiàn)自噬溶酶體內(nèi)高密度的電子顆粒溶解物。提示低濃度MnCl_2激發(fā)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生自噬。進(jìn)一步驗(yàn)證是否發(fā)生線粒體自噬,分別用Mitotracker Green和Lysotracker Red標(biāo)記線粒體和溶酶體結(jié)果發(fā)生重疊,呈明顯時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。自噬標(biāo)志性蛋白LC3發(fā)生明顯的LC3-Ι向LC3-II轉(zhuǎn)變。Beclin-1在4 h處表達(dá)量達(dá)到最大,6 h處有所降低。p62蛋白作為自噬降解底物隨著時(shí)間的增加表達(dá)量逐漸減少。4.MnCl_2致SH-SY5Y細(xì)胞線粒體損傷將SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞暴露于250μM MnCl_2分別染毒2、4、6 h,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)的方法,利用激光共聚焦、Image J軟件觀察、分析。結(jié)果顯示,線粒體膜電位隨著染毒時(shí)間的增加逐漸降低,線粒體受損。利用Mito SOX標(biāo)記線粒體內(nèi)活性氧產(chǎn)量,結(jié)果顯示線粒體內(nèi)活性氧聚集,并呈明顯的時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。表明過(guò)量MnCl_2可引起SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞線粒體的損傷。5.FOXO3在MnCl_2致SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬中的表達(dá)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞暴露于250μM MnCl_2分別染毒2、4、6 h,利用蛋白印跡法對(duì)線粒體相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,LC3-II/LC3-I、Beclin-1、PINK1蛋白在NC+Mn組暴露于250μM MnCl_2作用6 h后,表達(dá)明顯上升(P0.05)。同時(shí),si FOXO3+Mn組暴露于250μM MnCl_2作用6 h后其表達(dá)明顯低于NC+Mn組,與共聚焦結(jié)果一致。說(shuō)明FOXO3低表達(dá)對(duì)線粒體自噬起抑制作用。6.FOXO3在MnCl_2致SH-SY5Y細(xì)胞線粒體自噬中的核滯留將SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞暴露于250μM MnCl_2分別染毒2、4、6 h,蛋白印跡法分別對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中FOXO3蛋白進(jìn)行檢測(cè)。核中FOXO3與對(duì)照組相比表達(dá)在6 h處達(dá)到峰值。相反,細(xì)胞質(zhì)表達(dá)量隨時(shí)間增加逐漸降低。表明MnCl_2在誘導(dǎo)自噬的過(guò)程中促進(jìn)FOXO3核滯留。提示在MnCl_2致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞線粒體自噬過(guò)程中細(xì)胞核FOXO3參與并起重要作用。此外,線粒體自噬標(biāo)志性蛋白PINK1、P-parkin表達(dá)量隨時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸增加,并呈明顯時(shí)間依賴(lài)關(guān)系�？赡芘c其受核內(nèi)FOXO3調(diào)控表達(dá)上升促進(jìn)自噬發(fā)生有關(guān)。綜上,本研究揭示了細(xì)胞核內(nèi)FOXO3在MnCl_2致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞線粒體自噬中的作用并闡明了其可能存在的調(diào)控機(jī)制。MnCl_2可誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬水平增加,FOXO3可通過(guò)對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1、PINK1、P-parkin的調(diào)控對(duì)線粒體自噬起促進(jìn)作用。
[Abstract]:In this study , the effects of Mn Cl _ 2 on mitochondrial membrane potential and mitochondrial membrane potential were investigated . The results showed that the mitochondrial membrane potential decreased , the mitochondrial membrane potential decreased , the activity of reactive oxygen species ( ROS ) increased , and mitochondrial membrane potential decreased . The results showed that the mitochondrial membrane potential increased gradually with the increase of the time of 250 渭M MnCl _ 2 . The results showed that the mitochondrial membrane potential increased gradually with the increase of the time . The results showed that the mitochondrial membrane potential increased with the increase of the time of the cells exposed to 250 渭M MnCl _ 2 .

【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1454476