本文關鍵詞： 錳 線粒體自噬 SH-SY5Y神經細胞 FOXO3 神經毒性　出處：《首都醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：錳廣泛應用于工業(yè)生產中如采礦業(yè)、金屬冶煉、焊接等領域;同時由于含錳防爆劑甲基環(huán)戊二烯三羰基錳(Methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl,MMT)代替四乙基鉛廣泛使用,造成環(huán)境中過量錳暴露,對人體健康造成危害。錳化合物顆粒主要通過呼吸道進入人體,極易分布在富含線粒體的組織。腦排出速率較其它器官慢,吸收過量的錳化合物主要引起中樞神經系統(tǒng)病變,表現為帕金森樣癥狀。線粒體是為機體提供能量的主要場所,錳對線粒體有特殊親和力,可通過阻斷線粒體能量轉換、增加自由基產量影響線粒體功能,阻礙細胞呼吸,導致線粒體膜電位降低,活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生增加,線粒體損傷。隨著對帕金森疾病研究的不斷深入,已有研究證明線粒體損傷是錳引起帕金森疾病的重要機制之一。線粒體自噬作為線粒體質量控制的首要過程,參與MnCl_2致SH-SY5Y神經細胞自噬。有文獻報道,轉錄因子FOXO3調控線粒體自噬相關蛋白表達,但其是否參與MnCl_2致SH-SY5Y神經細胞線粒體自噬過程及其可能的調控機制尚不清楚。本研究利用MnCl_2染毒具有多巴胺能神經元特性的細胞系神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y),確定MnCl_2最適染毒劑量,在250μM MnCl_2染毒下觀察不同時間的線粒體自噬發(fā)生情況;并通過檢測線粒體功能指標如線粒體膜電位、線粒體內ROS產量;通過慢病毒si RNA沉默FOXO3基因(si FOXO3)實現FOXO3低表達,探討FOXO3在線粒體自噬發(fā)生中的分子機制。1.MnCl_2致SH-SY5Y細胞毒性的劑量效應關系將SH-SY5Y神經細胞分別暴露于250、500、1000μM MnCl_2染毒24 h,通過MTT法檢測MnCl_2對細胞的毒性作用。結果表明,隨著染毒濃度的增加,細胞存活率呈明顯的下降趨勢。于250μM MnCl_2處細胞存活率為84.3%±2.2%。各染毒組細胞存活率與對照組相比差別均具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。2.MnCl_2對SH-SY5Y細胞毒性的時間效應關系將SH-SY5Y神經細胞暴露于250μM MnCl_2分別染毒2、4、6、8、12、24 h,通過MTT法檢測MnCl_2對細胞的時間毒性作用。結果表明,隨著染毒時間的增加,細胞存活率呈下降趨勢。6 h處細胞存活率為82±3%,12 h細胞存活率80%,實驗組(除2 h外)細胞存活率與對照組相比差別均具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。3.MnCl_2致SH-SY5Y細胞線粒體自噬線粒體自噬是清除受損線粒體的有效途徑之一,本實驗通過TEM、激光共聚焦線粒體和溶酶體共定位及蛋白印記檢測線粒體自噬相關蛋白。結果可見自噬溶酶體內高密度的電子顆粒溶解物。提示低濃度MnCl_2激發(fā)SH-SY5Y神經細胞發(fā)生自噬。進一步驗證是否發(fā)生線粒體自噬,分別用Mitotracker Green和Lysotracker Red標記線粒體和溶酶體結果發(fā)生重疊,呈明顯時間依賴效應。自噬標志性蛋白LC3發(fā)生明顯的LC3-Ι向LC3-II轉變。Beclin-1在4 h處表達量達到最大,6 h處有所降低。p62蛋白作為自噬降解底物隨著時間的增加表達量逐漸減少。4.MnCl_2致SH-SY5Y細胞線粒體損傷將SH-SY5Y神經細胞暴露于250μM MnCl_2分別染毒2、4、6 h,運用流式細胞術的方法,利用激光共聚焦、Image J軟件觀察、分析。結果顯示,線粒體膜電位隨著染毒時間的增加逐漸降低,線粒體受損。利用Mito SOX標記線粒體內活性氧產量,結果顯示線粒體內活性氧聚集,并呈明顯的時間依賴效應。表明過量MnCl_2可引起SH-SY5Y神經細胞線粒體的損傷。5.FOXO3在MnCl_2致SH-SY5Y細胞線粒體自噬中的表達SH-SY5Y神經細胞暴露于250μM MnCl_2分別染毒2、4、6 h,利用蛋白印跡法對線粒體相關蛋白進行檢測。結果顯示,LC3-II/LC3-I、Beclin-1、PINK1蛋白在NC+Mn組暴露于250μM MnCl_2作用6 h后,表達明顯上升(P0.05)。同時,si FOXO3+Mn組暴露于250μM MnCl_2作用6 h后其表達明顯低于NC+Mn組,與共聚焦結果一致。說明FOXO3低表達對線粒體自噬起抑制作用。6.FOXO3在MnCl_2致SH-SY5Y細胞線粒體自噬中的核滯留將SH-SY5Y神經細胞暴露于250μM MnCl_2分別染毒2、4、6 h,蛋白印跡法分別對細胞核、細胞質中FOXO3蛋白進行檢測。核中FOXO3與對照組相比表達在6 h處達到峰值。相反,細胞質表達量隨時間增加逐漸降低。表明MnCl_2在誘導自噬的過程中促進FOXO3核滯留。提示在MnCl_2致SH-SY5Y神經細胞線粒體自噬過程中細胞核FOXO3參與并起重要作用。此外,線粒體自噬標志性蛋白PINK1、P-parkin表達量隨時間的增長逐漸增加,并呈明顯時間依賴關系。可能與其受核內FOXO3調控表達上升促進自噬發(fā)生有關。綜上,本研究揭示了細胞核內FOXO3在MnCl_2致SH-SY5Y神經細胞線粒體自噬中的作用并闡明了其可能存在的調控機制。MnCl_2可誘導細胞線粒體自噬水平增加,FOXO3可通過對自噬相關蛋白LC3、Beclin-1、PINK1、P-parkin的調控對線粒體自噬起促進作用。
[Abstract]:In this study , the effects of Mn Cl _ 2 on mitochondrial membrane potential and mitochondrial membrane potential were investigated . The results showed that the mitochondrial membrane potential decreased , the mitochondrial membrane potential decreased , the activity of reactive oxygen species ( ROS ) increased , and mitochondrial membrane potential decreased . The results showed that the mitochondrial membrane potential increased gradually with the increase of the time of 250 渭M MnCl _ 2 . The results showed that the mitochondrial membrane potential increased gradually with the increase of the time . The results showed that the mitochondrial membrane potential increased with the increase of the time of the cells exposed to 250 渭M MnCl _ 2 .

【學位授予單位】：首都醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：1454476