本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶熱失活機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶 熱穩(wěn)定性 解聚動(dòng)力學(xué) 平臺(tái)期

【摘要】：尿酸酶是治療高尿酸血癥的藥用酶和測(cè)定血清尿酸的工具酶,需提高其活性和熱穩(wěn)定性。天然產(chǎn)朊假絲酵母菌(C.G.M.C.C.2.1008)尿酸酶有優(yōu)良熱穩(wěn)定性;本文分析其熱失活過(guò)程解釋其機(jī)制。1.產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶熱失活曲線的表征產(chǎn)朊假絲酵母尿菌株(C.G.M.C.C.2.1008)擴(kuò)大培養(yǎng)后,經(jīng)尿酸誘導(dǎo),表達(dá)尿酸酶。離心收集菌體,超聲裂解,離心收集上清粗酶液,經(jīng)DEAE-cellulose 52纖維素柱純化,采用負(fù)吸附的方法,收集穿透液,經(jīng)PEG-20000濃縮,透析過(guò)夜。酶粗品經(jīng)上述步驟純化2次,得到尿酸酶純品,SDS-PAGE表征其純度,比活為10.0 kU g-1。樣品經(jīng)中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析中心分析證明:1)蛋白質(zhì)樣品純度為93.26%。2)肽鏈分子質(zhì)量17.35 k D。3)MALDI TOF/TOF分析證實(shí)其氨基酸序列類(lèi)似于FAD依賴(lài)性吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶(gi|154253900)。4)N端封閉而未能有效進(jìn)行Edman降解測(cè)定其N(xiāo)端氨基酸序列。酶蛋白保存體系,含抗生素,對(duì)氨基苯甲脒,EDTA,PMSF,小分子抑制劑類(lèi)配體及濃縮蛋白樣品,在37℃不同pH條件下保存。間隔一定時(shí)間取樣測(cè)定酶活性以記錄其衰減過(guò)程。發(fā)現(xiàn)該尿酸酶的熱失活過(guò)程分為顯著的兩個(gè)階段:前一階段其活性保持在一個(gè)平臺(tái)期(活性的下降不超過(guò)初始活性的10%),而后一階段尿酸酶的活性呈類(lèi)似指數(shù)衰減至30%以下,平臺(tái)期后活性衰減一半的時(shí)間段稱(chēng)為半衰期,這種特殊的熱失活現(xiàn)象稱(chēng)為平臺(tái)期效應(yīng)。在ph=7.4條件下,平臺(tái)期為4天,加入小分子抑制劑氧嗪酸鉀,平臺(tái)期增加至23天;在ph=9.2條件下,平臺(tái)期為12天,加入氧嗪酸鉀,平臺(tái)期延長(zhǎng)至24天。2.產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶熱失活模型的建立與分析公認(rèn)尿酸酶活性結(jié)構(gòu)形式為4個(gè)相同的單體聚合而成的四聚體。熱失活后的該假絲酵母尿酸酶樣品經(jīng)sds page及酸性page分析,發(fā)現(xiàn)大量四聚體解聚為二聚體和單體,而可溶性總蛋白量并未明顯減少,說(shuō)明尿酸酶熱失活的原因可能是由于寡聚體的解聚而非蛋白質(zhì)的降解。在含配體的保存體系中,四聚體減少的速度降低。在尿酸酶熱失活過(guò)程中,同四聚體與同二聚體間有多對(duì)非共價(jià)相互作用,在同四聚體解聚至兩個(gè)非變性同二聚體之前,存在多個(gè)構(gòu)象中間體。設(shè)最弱非共價(jià)相互作用的斷裂與再形成為基元反應(yīng)。假定在熱失活過(guò)程中,多個(gè)更強(qiáng)非共價(jià)相互作用的動(dòng)力學(xué)及熱力學(xué)的貢獻(xiàn)都可用多個(gè)基元反應(yīng)的累積貢獻(xiàn)而代替�；谝陨霞僭O(shè)建立如下動(dòng)力學(xué)模型:含有n個(gè)四聚體形態(tài)系列中間體定義為tm(其下標(biāo)m表示所含維持四聚體結(jié)構(gòu)的基元反應(yīng)數(shù)量);tm相互之間的差異僅在基元反應(yīng)數(shù)量;它們相互之間保持可逆動(dòng)態(tài)平衡;僅含一個(gè)基元反應(yīng)的四聚體狀態(tài)中間體最終可逆性轉(zhuǎn)化為非變性二聚體hd,而hd將進(jìn)一步不可逆轉(zhuǎn)化為變性的二聚體dd。將所涉及基元反應(yīng)的兩個(gè)方向及其它各轉(zhuǎn)化速率常數(shù)設(shè)為參數(shù),將四聚體總濃度歸一化;通過(guò)迭代數(shù)值積分計(jì)算給定參數(shù)組合所對(duì)應(yīng)的尿酸酶的熱失活曲線,用于最小二乘擬合(lsf)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的熱失活曲線,獲得所需參數(shù)組合。通過(guò)matlab軟件分析熱失活曲線,發(fā)現(xiàn)參數(shù)之間有嚴(yán)重的協(xié)方差;其中基元反應(yīng)斷裂的速度常數(shù)(k1)最關(guān)鍵。為消除參數(shù)之間的協(xié)方差,將k1設(shè)定為常數(shù)再擬合熱失活曲線且k1滿(mǎn)足如下要求:(a)以0.0001為速度常數(shù)下限;優(yōu)化k1使所有其它速度常數(shù)都大于0.001/min;(b)使m盡量小以降低計(jì)算量;(3)使得其他參數(shù)能夠關(guān)聯(lián)以便比較。據(jù)此擬合熱失活曲線結(jié)果表明:無(wú)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的條件下,在ph7.4時(shí)m=24,在ph9.2時(shí)m=64;在氧嗪酸鉀誘導(dǎo)條件下,在ph7.4時(shí)m=80,在ph9.2時(shí)m=140。進(jìn)一步分析各種條件下平臺(tái)期長(zhǎng)短及所得基元反應(yīng)逆反應(yīng)速度常數(shù)(k-1)、非變性二聚體再聚合成四聚體的速度常數(shù)k-2及非變性二聚體變性速度常數(shù)k2表明,此真菌尿酸酶活性指數(shù)下降之前的平臺(tái)期由m決定,而非k_2與k_1或k2;氧嗪酸鉀與此尿酸酶的結(jié)合可能導(dǎo)致其構(gòu)象變化,大大增加同二聚體之間的相互作用而提高四聚體穩(wěn)定性,并同時(shí)減少同二聚體的變性速度和再聚合成四聚體的速度。此尿酸酶熱失活平臺(tái)期長(zhǎng)短和指數(shù)衰減部分的半衰期不是尿酸酶同四聚體解離的熱力學(xué),而是其解聚動(dòng)力學(xué)決定的。3.熱失活動(dòng)力學(xué)模型的應(yīng)用以熱失活動(dòng)力學(xué)模型為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)了苛求芽孢桿菌尿酸酶突變體,將291位e-r離子鍵破壞,成功表達(dá)純化了突變體e291q。與野生型尿酸酶熱穩(wěn)定相比,e291q在不同ph條件下和氧嗪酸鉀配體誘導(dǎo)條件下,熱穩(wěn)定性均有所減弱。e291q在無(wú)配體誘導(dǎo)條件下,無(wú)平臺(tái)期,加入配體氧嗪酸鉀,觀察到明顯的平臺(tái)期,熱穩(wěn)定性明顯恢復(fù),但仍未達(dá)到野生型的熱穩(wěn)定性,說(shuō)明離子鍵的破壞對(duì)其熱穩(wěn)定性的降低有明顯作用。電泳結(jié)果顯示,e291q系統(tǒng)中四聚體和二聚體均有存在,且二聚體條帶中顯示出催化活性,可能在染色過(guò)程中其同二聚體在底物誘導(dǎo)下,重新組配成四聚體。以前文建立的尿酸酶動(dòng)力學(xué)模型分析e291q的熱失活過(guò)程,發(fā)現(xiàn)該模型能很好地?cái)M合其熱失活曲線。模型參數(shù)分析顯示,結(jié)合了氧嗪酸鉀分子后,尿酸酶同四聚體中間體數(shù)目明顯增加,說(shuō)明配體的結(jié)合使尿酸酶四聚體內(nèi)部的相互作用力明顯增加;動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示,E291Q在無(wú)氧嗪酸鉀結(jié)合的條件下,同四聚體間轉(zhuǎn)化的速率常數(shù)很高,同四聚體的穩(wěn)定性差,而在結(jié)合了底物之后,大量的非變性同二聚體又迅速組配成同四聚體,解釋了電泳圖中二聚體條帶存在的原因。小分子配體的結(jié)合增加了四聚體內(nèi)部相互作用的基元反應(yīng)數(shù)量,大大延長(zhǎng)了四聚體解聚的動(dòng)力學(xué)過(guò)程,延緩其熱失活而出現(xiàn)平臺(tái)期。同時(shí)推測(cè),尿酸酶中離子鍵的破壞將涉及尿酸酶表面整體靜電網(wǎng)絡(luò)的破壞,這種破壞在一定程度上通過(guò)pH效應(yīng)及配體誘導(dǎo)效應(yīng)恢復(fù),但無(wú)法達(dá)到最好的狀態(tài)。尿酸酶熱失活動(dòng)力學(xué)模型能有效預(yù)測(cè)并解釋尿酸酶熱失活的常見(jiàn)過(guò)程與現(xiàn)象,證明模型設(shè)計(jì)成功和其理論價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶 熱穩(wěn)定性 解聚動(dòng)力學(xué) 平臺(tái)期
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R915
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-16
• 第一部分 產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶熱失活曲線的表征16-27
• 1 材料與方法16-19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 3 結(jié)果與討論23-26
• 4 本部分小結(jié)26-27
• 第二部分 產(chǎn)朊假絲酵母尿酸酶熱失活模型的建立和分析27-33
• 1 材料與方法27-30
• 2.結(jié)果與討論30-32
• 3.本部分小結(jié)32-33
• 第三部分 尿酸酶熱失活動(dòng)力學(xué)模型的應(yīng)用33-39
• 1.材料與方法33
• 2.結(jié)果與討論33-38
• 3.本部分小結(jié)38-39
• 全文總結(jié)39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 致謝44-45
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文45

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 林聽(tīng)寶;;測(cè)定血清和尿液中尿酸的新的酶促法[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);1982年01期

2 劉廣楨,陳建華,王e，

本文編號(hào)：591465