本文關鍵詞：產朊假絲酵母尿酸酶熱失活機制的研究

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【摘要】：尿酸酶是治療高尿酸血癥的藥用酶和測定血清尿酸的工具酶,需提高其活性和熱穩(wěn)定性。天然產朊假絲酵母菌(C.G.M.C.C.2.1008)尿酸酶有優(yōu)良熱穩(wěn)定性;本文分析其熱失活過程解釋其機制。1.產朊假絲酵母尿酸酶熱失活曲線的表征產朊假絲酵母尿菌株(C.G.M.C.C.2.1008)擴大培養(yǎng)后,經尿酸誘導,表達尿酸酶。離心收集菌體,超聲裂解,離心收集上清粗酶液,經DEAE-cellulose 52纖維素柱純化,采用負吸附的方法,收集穿透液,經PEG-20000濃縮,透析過夜。酶粗品經上述步驟純化2次,得到尿酸酶純品,SDS-PAGE表征其純度,比活為10.0 kU g-1。樣品經中國科學院上海生命科學研究院蛋白質組學研究分析中心分析證明:1)蛋白質樣品純度為93.26%。2)肽鏈分子質量17.35 k D。3)MALDI TOF/TOF分析證實其氨基酸序列類似于FAD依賴性吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶(gi|154253900)。4)N端封閉而未能有效進行Edman降解測定其N端氨基酸序列。酶蛋白保存體系,含抗生素,對氨基苯甲脒,EDTA,PMSF,小分子抑制劑類配體及濃縮蛋白樣品,在37℃不同pH條件下保存。間隔一定時間取樣測定酶活性以記錄其衰減過程。發(fā)現(xiàn)該尿酸酶的熱失活過程分為顯著的兩個階段:前一階段其活性保持在一個平臺期(活性的下降不超過初始活性的10%),而后一階段尿酸酶的活性呈類似指數衰減至30%以下,平臺期后活性衰減一半的時間段稱為半衰期,這種特殊的熱失活現(xiàn)象稱為平臺期效應。在ph=7.4條件下,平臺期為4天,加入小分子抑制劑氧嗪酸鉀,平臺期增加至23天;在ph=9.2條件下,平臺期為12天,加入氧嗪酸鉀,平臺期延長至24天。2.產朊假絲酵母尿酸酶熱失活模型的建立與分析公認尿酸酶活性結構形式為4個相同的單體聚合而成的四聚體。熱失活后的該假絲酵母尿酸酶樣品經sds page及酸性page分析,發(fā)現(xiàn)大量四聚體解聚為二聚體和單體,而可溶性總蛋白量并未明顯減少,說明尿酸酶熱失活的原因可能是由于寡聚體的解聚而非蛋白質的降解。在含配體的保存體系中,四聚體減少的速度降低。在尿酸酶熱失活過程中,同四聚體與同二聚體間有多對非共價相互作用,在同四聚體解聚至兩個非變性同二聚體之前,存在多個構象中間體。設最弱非共價相互作用的斷裂與再形成為基元反應。假定在熱失活過程中,多個更強非共價相互作用的動力學及熱力學的貢獻都可用多個基元反應的累積貢獻而代替�；谝陨霞僭O建立如下動力學模型:含有n個四聚體形態(tài)系列中間體定義為tm(其下標m表示所含維持四聚體結構的基元反應數量);tm相互之間的差異僅在基元反應數量;它們相互之間保持可逆動態(tài)平衡;僅含一個基元反應的四聚體狀態(tài)中間體最終可逆性轉化為非變性二聚體hd,而hd將進一步不可逆轉化為變性的二聚體dd。將所涉及基元反應的兩個方向及其它各轉化速率常數設為參數,將四聚體總濃度歸一化;通過迭代數值積分計算給定參數組合所對應的尿酸酶的熱失活曲線,用于最小二乘擬合(lsf)實驗測定的熱失活曲線,獲得所需參數組合。通過matlab軟件分析熱失活曲線,發(fā)現(xiàn)參數之間有嚴重的協(xié)方差;其中基元反應斷裂的速度常數(k1)最關鍵。為消除參數之間的協(xié)方差,將k1設定為常數再擬合熱失活曲線且k1滿足如下要求:(a)以0.0001為速度常數下限;優(yōu)化k1使所有其它速度常數都大于0.001/min;(b)使m盡量小以降低計算量;(3)使得其他參數能夠關聯(lián)以便比較。據此擬合熱失活曲線結果表明:無氧嗪酸鉀誘導的條件下,在ph7.4時m=24,在ph9.2時m=64;在氧嗪酸鉀誘導條件下,在ph7.4時m=80,在ph9.2時m=140。進一步分析各種條件下平臺期長短及所得基元反應逆反應速度常數(k-1)、非變性二聚體再聚合成四聚體的速度常數k-2及非變性二聚體變性速度常數k2表明,此真菌尿酸酶活性指數下降之前的平臺期由m決定,而非k_2與k_1或k2;氧嗪酸鉀與此尿酸酶的結合可能導致其構象變化,大大增加同二聚體之間的相互作用而提高四聚體穩(wěn)定性,并同時減少同二聚體的變性速度和再聚合成四聚體的速度。此尿酸酶熱失活平臺期長短和指數衰減部分的半衰期不是尿酸酶同四聚體解離的熱力學,而是其解聚動力學決定的。3.熱失活動力學模型的應用以熱失活動力學模型為基礎,設計了苛求芽孢桿菌尿酸酶突變體,將291位e-r離子鍵破壞,成功表達純化了突變體e291q。與野生型尿酸酶熱穩(wěn)定相比,e291q在不同ph條件下和氧嗪酸鉀配體誘導條件下,熱穩(wěn)定性均有所減弱。e291q在無配體誘導條件下,無平臺期,加入配體氧嗪酸鉀,觀察到明顯的平臺期,熱穩(wěn)定性明顯恢復,但仍未達到野生型的熱穩(wěn)定性,說明離子鍵的破壞對其熱穩(wěn)定性的降低有明顯作用。電泳結果顯示,e291q系統(tǒng)中四聚體和二聚體均有存在,且二聚體條帶中顯示出催化活性,可能在染色過程中其同二聚體在底物誘導下,重新組配成四聚體。以前文建立的尿酸酶動力學模型分析e291q的熱失活過程,發(fā)現(xiàn)該模型能很好地擬合其熱失活曲線。模型參數分析顯示,結合了氧嗪酸鉀分子后,尿酸酶同四聚體中間體數目明顯增加,說明配體的結合使尿酸酶四聚體內部的相互作用力明顯增加;動力學參數顯示,E291Q在無氧嗪酸鉀結合的條件下,同四聚體間轉化的速率常數很高,同四聚體的穩(wěn)定性差,而在結合了底物之后,大量的非變性同二聚體又迅速組配成同四聚體,解釋了電泳圖中二聚體條帶存在的原因。小分子配體的結合增加了四聚體內部相互作用的基元反應數量,大大延長了四聚體解聚的動力學過程,延緩其熱失活而出現(xiàn)平臺期。同時推測,尿酸酶中離子鍵的破壞將涉及尿酸酶表面整體靜電網絡的破壞,這種破壞在一定程度上通過pH效應及配體誘導效應恢復,但無法達到最好的狀態(tài)。尿酸酶熱失活動力學模型能有效預測并解釋尿酸酶熱失活的常見過程與現(xiàn)象,證明模型設計成功和其理論價值。
【關鍵詞】：產朊假絲酵母尿酸酶 熱穩(wěn)定性 解聚動力學 平臺期
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R915
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-16
• 第一部分 產朊假絲酵母尿酸酶熱失活曲線的表征16-27
• 1 材料與方法16-19
• 2 實驗方法19-23
• 3 結果與討論23-26
• 4 本部分小結26-27
• 第二部分 產朊假絲酵母尿酸酶熱失活模型的建立和分析27-33
• 1 材料與方法27-30
• 2.結果與討論30-32
• 3.本部分小結32-33
• 第三部分 尿酸酶熱失活動力學模型的應用33-39
• 1.材料與方法33
• 2.結果與討論33-38
• 3.本部分小結38-39
• 全文總結39-40
• 參考文獻40-44
• 致謝44-45
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文45

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1 林聽寶;;測定血清和尿液中尿酸的新的酶促法[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;1982年01期

2 劉廣楨,陳建華,王e，

本文編號：591465