本文關(guān)鍵詞：靶向腫瘤干細(xì)胞抗體偶聯(lián)藥物AC133-L1-MMAF的構(gòu)建及其藥效學(xué)實驗研究

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【摘要】：腫瘤細(xì)胞群體中具有自我更新能力和分化潛能的小部分腫瘤細(xì)胞被稱之為腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells,CSCs),它是腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和治療抵抗的“種子細(xì)胞”,臨床證據(jù)也顯示腫瘤干細(xì)胞可能是腫瘤演進(jìn)的根源。腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和證實為腫瘤的高效治療提供了新的契機(jī),促使我們重新考察傳統(tǒng)的惡性腫瘤治療策略。因此,靶向腫瘤干細(xì)胞的特異性殺傷有望為改善惡性腫瘤療效帶來新的希望,而用于分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)記為高效的主動靶向提供了潛在位點�；诖�,本文提出利用篩選腫瘤干細(xì)胞的特異性抗體構(gòu)建抗體-藥物偶聯(lián)物(Antibody-drug conjugate,ADC)靶向性殺傷腫瘤的策略,以期極大地提高腫瘤治療效果。本課題以結(jié)腸癌為例,選用可抑制微管組裝而影響細(xì)胞有絲分裂的強(qiáng)細(xì)胞毒素阿里他汀(Auristatins)的衍生物Monomethyl Auristatin F(MMAF)作為ADC的偶聯(lián)藥物;選用結(jié)腸癌干細(xì)胞表面的特異標(biāo)記CD133分子的抗體AC133作為偶聯(lián)抗體,構(gòu)建靶向結(jié)腸癌干細(xì)胞的抗體偶聯(lián)藥物。合成、純化和表征ADCs藥物AC133-L1-MMAF(L1:Maleimidocaproyl-val-cit-pABC)后,以CT-26細(xì)胞為研究對象,體外分析評價AC133-L1-MMAF對CD133+細(xì)胞的主動靶向性和細(xì)胞毒性;構(gòu)建CB-17/SCID小鼠體內(nèi)移植瘤模型,評價ADC體內(nèi)抗腫瘤活性。通過本課題的研究,不僅能為腫瘤治療提供全新的策略,還能為針對腫瘤細(xì)胞不同分化型態(tài)給藥提供實驗和理論依據(jù)。本課題主要內(nèi)容和結(jié)果有:(1)選用小鼠結(jié)腸癌干細(xì)胞上的標(biāo)記物CD133抗體anti-CD133(AC133)作為偶聯(lián)抗體,以細(xì)胞微管類毒素藥物阿里他汀的衍生物MMAF作為偶聯(lián)藥物,以maleimidocaproyl-val-cit-p ABC作為鏈接子,合成抗體偶聯(lián)藥物AC133-maleimidocaproyl-val-cit-pABC-MMAF(AC133-L1-MMAF);通過SDS-PAGE、RP-HPLC等表征AC133與L1-MMAF偶聯(lián)。SDS-PAGE實驗結(jié)果表明,單抗AC133在連接上MMAF之后分子量增大;RP-HPLC結(jié)果表明:在單抗AC133的特征吸收波長280nm處出現(xiàn)兩個吸收峰,查閱文獻(xiàn)得知依次為抗體的輕鏈和重鏈,在MMAF的最大吸波長220nm處并無吸收峰出現(xiàn),而ADC在220nm和280nm處均檢測到吸收峰,出峰時間相近。由以上結(jié)果可說明AC133與L1-MMAF連接成功;(2)以小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26為研究對象,通過MTT法檢測ADC、DOX和L1-MMAF對CT-26細(xì)胞的毒性。實驗結(jié)果表明,給藥72h后ADC的IC50值為0.182±0.004nM,而72h后L1-MMAF的IC50值為2.642±0.179u M,DOX為8.986±0.163uM,與L1-MMAF和DOX比較,統(tǒng)計學(xué)差異顯著,表明ADC對CT-26/CD133+細(xì)胞有更強(qiáng)的毒性;以相同濃度的ADC、DOX和L1-MMAF處理CT-26/CD133+細(xì)胞和鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞pc12/CD133-細(xì)胞發(fā)現(xiàn),ADC對CD133+細(xì)胞有更強(qiáng)的毒性;通過免疫熒光標(biāo)記法分別檢測ADC-AF488對未被飽和的CD133+細(xì)胞和被飽和的CD133+細(xì)胞的結(jié)合能力,實驗發(fā)現(xiàn)ADC與未飽和CD133+細(xì)胞結(jié)合后細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度較高,而經(jīng)過AC133飽和后的CD133+細(xì)胞表面幾乎檢測不到熒光,表明ADC對CD133+細(xì)胞具有良好的靶向結(jié)合能力;以流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)過ADC和DOX處理后的CT-26細(xì)胞群體中CD133+細(xì)胞的比例,結(jié)果表明經(jīng)過ADC處理后CT-26細(xì)胞中CD133+比例降低約0.7%,而經(jīng)DOX處理后的CT-26細(xì)胞群體中CD133+比例并無顯著變化,進(jìn)一步說明ADC靶向性殺傷CD133+細(xì)胞;Western blotting結(jié)果顯示ADC處理能上調(diào)胞內(nèi)Jak信號通路蛋白p-STAT3的表達(dá);(3)利用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞構(gòu)建SCID小鼠皮下移植瘤模型,小鼠腫瘤成瘤率約為90%。采用尾部靜脈注射給藥,通過小鼠腫瘤體積變化,體重變化,藥物抑瘤率以及生存實驗評價不同劑量的ADC、L1-MMAF和DOX的體內(nèi)活性。實驗結(jié)果表明,當(dāng)ADC劑量為4mg/kg時模型小鼠體重穩(wěn)定,腫瘤生長受抑制程度最大,最高僅為200mm3左右,給藥結(jié)束后腫瘤不斷變小直至幾乎消失(80d),其次為2mg/kg的ADC組和DOX(8mg/kg)組,腫瘤生長均受到不同程度的抑制,且很大程度上延長了小鼠的生存時間,與4mg/kg ADC組相比差異顯著(p0.05)。分別取給藥組(4mg/kg ADC)和對照組小鼠的腫瘤組織作病理切片觀察,HE染色結(jié)果表明病理切片為正常腫瘤組織切片,其中給藥組腫瘤細(xì)胞死亡區(qū)域較多,核膜溶解情況嚴(yán)重,對照組小鼠腫瘤細(xì)胞排列有序,細(xì)胞形態(tài)良好;腫瘤切片免疫組化實驗結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)明顯CD133陽性表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：腫瘤干細(xì)胞 抗體偶聯(lián)藥物 靶向性 結(jié)腸癌 移植瘤
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 縮略詞表10-11
• 1 緒論11-15
• 1.1 課題提出11-12
• 1.2 研究內(nèi)容12-13
• 1.2.1 AC133-L1-MMAF的合成與連接結(jié)構(gòu)鑒定12-13
• 1.2.2 AC133-L1-MMAF的體外活性鑒定13
• 1.2.3 ADC體內(nèi)藥效學(xué)實驗研究13
• 1.3 技術(shù)路線13-15
• 2 抗體偶聯(lián)藥物的合成與表征15-23
• 2.1 材料及儀器15-16
• 2.1.1 主要材料試劑15
• 2.1.2 儀器15-16
• 2.1.3 相關(guān)溶液配制16
• 2.2 AC133-L1-MMAF的合成與鑒定16-18
• 2.2.1 合成AC133-L1-MMAF16-17
• 2.2.2 抗體偶聯(lián)藥物純化17
• 2.2.3 藥抗比率（drug/antibody ratio, DAR）測定17
• 2.2.4 偶聯(lián)物分子量鑒定17-18
• 2.2.5 RP-HPLC18
• 2.3 實驗結(jié)果18-22
• 2.3.1 SDS-PAGE18-19
• 2.3.2 偶聯(lián)比測定19-20
• 2.3.3 RP-HPLC分析20-22
• 2.4 小結(jié)及討論22-23
• 3 AC133-L1-MMAF體外藥效學(xué)實驗23-37
• 3.1 材料及儀器23-24
• 3.1.1 材料及試劑23
• 3.1.2 主要儀器及耗材23-24
• 3.1.3 相關(guān)溶液配制24
• 3.2 AC133-L1-MMAF細(xì)胞活性研究24-25
• 3.2.1 細(xì)胞實驗相關(guān)操作24-25
• 3.2.2 細(xì)胞毒性檢測25
• 3.3 AC133-L1-MMAF對CT-26 細(xì)胞靶向性表征25-26
• 3.3.1 AC133-L1-MMAF靶向殺傷性實驗25
• 3.3.2 AC133-L1-MMAF親和性實驗25-26
• 3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測26
• 3.4.1 細(xì)胞給藥處理26
• 3.4.2 流式分析26
• 3.5 Western Blot26-27
• 3.5.1 STAT3及p-STAT3蛋白提取26
• 3.5.2 Western Blot操作26-27
• 3.6 結(jié)果27-34
• 3.6.1 AC133-L1-MMAF細(xì)胞活性研究27-31
• 3.6.2 ADC對CD133+細(xì)胞靶向性評價31-34
• 3.6.3 STAT3及p-STAT3表達(dá)變化34
• 3.7 小結(jié)及討論34-37
• 4 Anti-CD133-L1-MMAF體內(nèi)藥效實驗研究37-47
• 4.1 材料及儀器37-38
• 4.1.1 主要試劑及相關(guān)溶液配制37
• 4.1.2 主要耗材及儀器37-38
• 4.2 實驗過程38-40
• 4.2.1 構(gòu)建免疫缺陷型小鼠移植瘤模型38
• 4.2.2 實驗設(shè)計及給藥38
• 4.2.3 指標(biāo)檢測38-39
• 4.2.4 組織學(xué)觀察39-40
• 4.3 實驗結(jié)果40-45
• 4.3.1 接種細(xì)胞活性檢測40
• 4.3.2 荷瘤小鼠生長狀態(tài)40-42
• 4.3.3 AC133-L1-MMAF體內(nèi)活性表征42-44
• 4.3.4 病理觀察及免疫組化結(jié)果44-45
• 4.4 小結(jié)及討論45-47
• 5 結(jié)論與展望47-49
• 5.1 主要結(jié)論47-48
• 5.2 后續(xù)工作及建議48-49
• 6 文獻(xiàn)綜述49-59
• 6.1 抗體偶聯(lián)藥物的研究進(jìn)展49-56
• 6.1.1 市場現(xiàn)狀49-54
• 6.1.2 抗體偶聯(lián)藥物分類54-56
• 6.2 抗體偶聯(lián)藥物作用機(jī)制與缺陷56-57
• 6.3 影響抗體偶聯(lián)藥物的因素57-59
• 6.3.1 抗體偶聯(lián)藥物分子大小57
• 6.3.2 連接藥物的選擇57
• 6.3.3 linker的選擇57-58
• 6.3.4 藥物對腫瘤細(xì)胞的毒性58
• 6.3.5 腫瘤標(biāo)志物的特異性58-59
• 致謝59-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 附錄69
• 碩士期間發(fā)表論文69
• 主持和參與的科研項目69

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本文編號：511915