本文關(guān)鍵詞：依賴于靶點(diǎn)穩(wěn)定性的藥物親和反應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件探索，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的對(duì)依賴于靶點(diǎn)穩(wěn)定性的藥物親和反應(yīng)(DARTS)這一靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)新技術(shù)進(jìn)行主要影響因素的探索,獲得DARTS更適宜的實(shí)驗(yàn)條件。方法采用不同濃度的鏈霉蛋白酶(酶與蛋白質(zhì)量比1∶100~1∶10 000)對(duì)Jurkat細(xì)胞提取的蛋白混合物進(jìn)行室溫酶解,通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和考馬斯亮藍(lán)染色,觀察不同濃度鏈霉蛋白酶對(duì)蛋白混合物酶解的程度,以確定DARTS適宜的酶解濃度范圍。在此基礎(chǔ)上,以α-酮戊二酸為研究對(duì)象,采用DARTS聯(lián)合SDS-PAGE,考察不同鏈霉蛋白酶濃度(酶與蛋白質(zhì)量比為1∶500~1∶5000)和不同酶解時(shí)長(zhǎng)(5~30 min)對(duì)DARTS結(jié)果的影響,獲得適宜的酶解條件。選用靶標(biāo)已知的麥考酚酸,采用上述實(shí)驗(yàn)所得的最適酶解條件進(jìn)行DARTS,驗(yàn)證其可行性。結(jié)果采用不同濃度鏈酶蛋白酶對(duì)蛋白混合物進(jìn)行酶解時(shí),濃度為1∶100的條件下蛋白完全被水解,酶濃度為1∶10 000對(duì)蛋白混合物無(wú)明顯水解,酶濃度為1∶500~1∶5000較溫和,約可水解蛋白混合物的30%~60%。鏈霉蛋白酶濃度為1∶1000時(shí),α-酮戊二酸的DARTS中受保護(hù)的蛋白條帶呈現(xiàn)效果最好;在該酶濃度條件下,適宜的酶解時(shí)長(zhǎng)為15 min。將以上酶解條件(鏈霉蛋白酶濃度1∶1000、酶解15 min)運(yùn)用于麥考酸的DARTS,在4~7×10~4處可見(jiàn)明顯的保護(hù)條帶,Western免疫印跡法驗(yàn)證結(jié)果顯示,保護(hù)條帶中含有麥考酚酸靶蛋白IMPDH 1。結(jié)論以α-酮戊二酸為研究對(duì)象,獲得了蛋白混合物DARTS更適宜的實(shí)驗(yàn)條件。
【作者單位】： 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： 活性小分子化合物 依賴于靶點(diǎn)穩(wěn)定性的藥物親和反應(yīng) 靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)
【基金】：國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012ZX09301003-001-006,2012ZX09301003-004-002,2013ZX09402203003)
【分類號(hào)】：R96
【正文快照】： 活性小分子化合物的靶標(biāo)研究一直都是新藥創(chuàng)新性研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。迄今為止,許多經(jīng)典小分子化合物的結(jié)合蛋白皆由基于親和原理的直接分離方法獲得,如通過(guò)親和層析法發(fā)現(xiàn)了免疫抑制劑他克莫司(FK506)的結(jié)合蛋白FKBP12[1]、環(huán)孢菌素A的結(jié)合蛋白親環(huán)蛋白[2-3]、沙利度胺致畸的主

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本文編號(hào)：481339